论文摘要
弯曲菌（Campylobacter）是全球范围内主要的人兽共患性、细菌性肠道病原菌之一,对人致病的弯曲菌中99%的是空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni,C. jejuni）,其次是结肠弯曲菌（Campylobacter coli,C. coli）,其它弯曲菌偶尔致病。特定血清型空肠弯曲菌引起的肠炎是人格林-巴利综合征（Guillain-Barre syndrome,GBS）的重要前驱因子。近年来,许多国家人弯曲菌病的发生率呈指数增长趋势。弯曲菌是野生、家养动物的正常寄居菌,在肠道内有大量细菌,感染的动物通常无明显病症,但可长期向外界排菌,通过排泄物或分娩污染食物和饮水,从而引起人类感染。其中,家禽是弯曲菌病最重要的传染源,控制或清除禽类弯曲菌是预防和控制人空肠弯曲菌的重要前提。本研究的主要内容与目的是:（1）较为系统地调查与分析我国部分地区鸡群中弯曲菌流行特点,并应用国标方法鉴定分离株的生化特性,以2005年美国临床实验室标准化研究所（CLSI）推荐使用的琼脂扩散法进行耐药分析;（2）鸡源空肠弯曲菌地方分离株毒力相关基因分析及对HT-29细胞感染分析;（3）基于RAPD和PFGE技术的不同源空肠弯曲菌分离株分子亚分型研究,探究鸡空肠弯曲菌在人弯曲菌病中的作用;（4）鸡空肠弯曲菌新型DNA疫苗构建及其免疫生物学特性。1我国部分地区鸡群中弯曲菌流行现状和耐药特性调查与分析2005年7月至2007年12月,选取我国部分省市,采集不同品种、不同类型的鸡群样品进行空肠弯曲菌和结肠弯曲菌流行病学调查,40个鸡群中空肠弯曲菌阳性的有34个,阳性率为85%、结肠弯曲菌阳性率40%。在4 891份鸡肛门棉拭样品中,共检测出773份空肠弯曲菌阳性、平均阳性率15.80%,55份结肠弯曲菌阳性、平均阳性率1.12%;其中空肠弯曲菌和结肠弯曲菌混合污染的样品为19份,平均阳性率0.39%以上;鸡饲养环境样品217份,6份空肠弯曲菌阳性,阳性率2.76%。不同鸡群感染率悬殊较大,空肠弯曲菌阳性率从0到73.3%、结肠弯曲菌从0到7.4%。流行病学统计分析表明,规模化饲养鸡群的感染率显著高于散养鸡群（p<0.01）,品系鸡群显著高于非品系（p<0.01）,不同品系鸡群的感染率存在较大差异,我国地方品种鸡的鸡群感染率较低,祖代鸡群的感染率显著高于商品代和父母代（p<0.01）。240株鸡源空肠弯曲菌、34株结肠弯曲菌的生化特性和耐药性研究显示,空肠弯曲菌对8大类21种抗生素高度敏感的是:阿莫西林（AMC）96.67%、庆大霉素（CN）90.00%、阿齐红霉素（AZM）91.25%、链霉素（S）87.92%、红霉素（E）85.42%,高度耐药的是:头孢拉定（CE）98.33%、头孢哌酮（CFP）100.00%、头孢克罗（CEC）92.50%、诺氟沙星（NOR）92.08%、恩诺沙星（ENR）95.68%、环丙沙星（CIP）92.08%、左悬氧氟沙星（LEV）91.25%、复方新诺明（SXT）99.58%、四环素（TE）89.58%、强力霉素（DO）88.33%;耐药谱主要集中在8耐至14耐,达90.00%。34株结肠弯曲菌只对阿莫西林（AMC）高度敏感,91.18%。结肠弯曲菌耐药性和多重耐药性较空肠弯曲菌更为严重。不同地区、不同种类鸡群分离株耐药性和多重耐药性存在差异。我国鸡群的空肠弯曲菌对临床上常用的喹诺酮类、磺胺类、四环素类和大多数头孢菌素类抗生素均产生了不同程度的耐药性;而且结肠弯曲菌的耐药性更为严重,值得关注,必须加强各地弯曲菌耐药性和抗生素使用情况的监测,及时调整用药方案和公共卫生策略。2鸡源空肠弯曲菌地方分离株毒力相关基因分析及对HT-29细胞感染分析282株鸡源空肠弯曲菌地方分离株毒力相关基因分析显示,黏附相关基因cadF、peb1A、racR的平均携带率分别为90.07%、95.04%和97.87%,趋化性调节基因cheY、docA的平均携带率分别为95.39%和92.20%,侵袭蛋白基因iamA的平均携带率为87.94%,鞭毛蛋白基因flaA的平均携带率为86.17%,毒素调节基因cdt、wlaN和virB11质粒基因的平均携带率分别为71.28%、48.94%和7.08%;86.75%的细菌含有6个以上的毒力相关基因。结果显示,不同来源鸡分离株的毒力相关基因携带无显著性差异。分离株对HT-29细胞的侵袭力试验表明,119株分离株中,65株细菌无侵袭能力,占总数的54.62%;44株细菌的侵袭能力比较低,在0.0001%-0.1%之间,菌株所占比例为36.97%;10株细菌的侵袭能力较高,在0.1%-2%之间,比例为8.40%。不同侵袭能力分离株毒力相关基因分析显示:随着侵袭力的不同,分离株的基因携带有一定变化,flaA、cadF、docA、racR、iamA、peb1A和cheY的携带率随侵袭力上升而下降,而wlaN和cdt随侵袭力上升而上升。侵袭力与相关基因有密切关系,但非一一对应关系,而是相互作用,互为交叉的关系。不同谱系分离株对HT-29的黏附率和侵袭率表明,谱系Ⅳ分离株高于谱系Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分离株,相关毒力基因分析显示,在空肠弯曲菌侵袭HT-29上皮细胞过程中,黏附相关基因cadF、peb1A、racR,趋化性调节基因cheY、docA和侵袭蛋白基因iamA起重要作用。3不同源空肠弯曲菌分离株RAPD和PFGE分子亚分型研究337株不同来源的空肠弯曲菌PCR-RAPD分析表明,共得到27个基因型别,主要型别有5、6、7、9、12、14、15、22,占83.09%,其中菌株分布最集中的是型别5、9、14和15,所占比例分别为14.84%、17.51%、11.28%和12.76%,而在型别1-4、8、10、13、17、20、21和24-27中出现的菌株较少,比例均低于1%。此外,在不同来源分离的菌株中均含有5、7、9、14和15基因型别,占63.51%。276株不同源分离株PFGE图谱可分为4个遗传谱系、46个克隆组群,且我国空肠弯曲菌分离株主要属于PFGE遗传谱系Ⅲ和Ⅳ。不同源分离株在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ遗传谱系中,不同源分离株在各克隆组群中呈交叉分布,鸡源分离株均占有优势,分别为50%、65%、70.59%、64.10%,而腹泻病人、牛群和市场食品分离株遗传谱型分布于各型中,表明鸡是空肠弯曲菌感染的主要来源。分子亚分型研究分析表明,PCR-RAPD和PFGE可作为研究空肠弯曲菌来源和传播途径的有力工具,且PFGE的分辨力强于PCR-RAPD。我国空肠弯曲菌分离株存在优势的遗传谱系,不同源分离株呈高度交叉分布,人弯曲菌的感染与市场食品、动物源弯曲菌感染密切相关,可能存在着相同的传染源,而且鸡源弯曲菌是人类弯曲菌病的主要传染源之一。4运送空肠弯曲菌flaA基因的壳聚糖纳米DNA疫苗免疫生物学特性根据GenBank登陆序列（gi:30407139）,利用DNAStar软件分析,按正确的阅读顺序设计合成引物,PCR扩增空肠弯曲菌鞭毛蛋白基因flaA,将PCR产物回收、序列测定后,与pGEM○R T easy vector连接构建重组质粒pT-flaA,用EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切回收后插入经同样双酶切的pCAGGS载体,构建成pCAGGS-flaA。将重组质粒pCAGGS-flaA转染COS-7细胞,间接免疫荧光检测表明重组质粒pCAGGS-flaA在转染的COS-7细胞中能检测到表达蛋白。应用现代纳米技术研制壳聚糖-重组质粒,1%琼脂糖电泳检测表明壳聚糖已经包裹了质粒,包裹率达91.9%,透射电子显微镜观察到壳聚糖已将质粒包裹形成直径100 nm左右的圆球形颗粒。白莱航鸡动物试验显示,二免后14天均能检测到特异性抗体,但抗体滴度较低;三免后14天抗体水平上升明显,能诱导鸡产生针对空肠弯曲菌鞭毛蛋白的体液、黏膜免疫应答,且与对照组具有显著性差异（p<0.01）;流式细胞仪测定鸡脾脏和盲肠扁桃体CD4+/CD8+细胞的数量变化表明,CS-pCAGGS-flaA三免后导致脾脏和盲肠扁桃体CD4+/CD8+细胞数量比值的升高,CD4+细胞的数量高于CD8+细胞。RT-PCR测定鸡脾脏细胞IL-4、IFN-γ可知,二免、三免后14天脾脏细胞IL-4的量强于对照组,且IL-4的量强于IFN-γ。口服攻毒后,疫苗组在测定的时间内泄殖腔排毒率呈现下降趋势,21d后的排毒率为0,而对照组的排毒率保持相对稳定、高排毒水平;空肠弯曲菌在疫苗组小肠、大肠、盲肠和血液中的细菌量大致呈抛物线状,大约在9d-15d间达到高峰,然后呈下降趋势;而对照组在各脏器的分布呈上升趋势。免疫组小肠、大肠、盲肠和血液中细菌的细菌数量均低于对照组, 18d后能有效清除小肠内空肠弯曲菌,免疫组大肠、盲肠和血液的细菌数量较对照组分别降低2lg-3 lg、2lg和2lg-3lg数量。