玉米2C型丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶活性与耐旱性的关系

论文摘要

干旱是玉米生产中最重要的非生物胁迫之一。研究表明,玉米不同自交系在耐旱性上存在显著差异。但是,耐旱性是众多形态、生理和生化特性协同作用的结果,而且不同的基因型可能涉及不同的胁迫应答方式,加之环境因素的干扰,耐旱性的鉴定在通常条件下比较困难。因此,耐旱候选基因的鉴定将有助于提高耐旱分子标记辅助选择育种的效率。同时,对于改良玉米品种的耐旱性有重要的指导意义。在前期研究中,本实验室结合干旱地区品种推广实践,在严格控制土壤水分的干旱条件下,从57个常用玉米自交系中筛选出3个耐旱自交系“81565”、“N87-1”、“R09”和3个不耐旱自交系“200B”、“ES40”、“丹340”。并利用改进的DDRT-PCR技术分析玉米强耐旱自交系“81565”在干旱处理和正常浇水对照差异表达的基因,发现MD1、MD2和MD3三个在干旱胁迫下差异表达的基因片段,其中MD2为下调表达。序列分析和同源性比较表明,MD2与极端耐旱的鼠尾栗属Sporobolus stapfianus丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶2C（PP2C）基因有88%相似性。采用电子克隆和RT-PCR技术相结合的方法克隆MD2基因片段的cDNA全序列,克隆的全长cDNA序列ZmPP2Ca为玉米PP2C基因家族的新成员,开放阅读框长1164 bp,编码388个氨基酸残基。本研究采用盆栽实验在模拟干旱胁迫和正常浇水条件下,选用三个耐旱自交系“81565”、“N87-1”和“R09”及三个不耐旱自交性“200B”、“ES40”和“丹340”,应用实时荧光定量PCR技术,对干旱胁迫下ZmPP2Cα基因在不同玉米自交系中的表达量进行检测。结果表明,在干旱胁迫下,ZmPP2Cα基因在3个耐旱自交系“81565”、“R09”和“N87-1”中的表达量呈现下调表达的模式,在胁迫处理6 h时,表达量降到最低水平;在3个不耐旱自交系“200B”、“ES40”和“丹340”中的表达量呈现上调表达的模式。参考催化其逆反应的蛋白磷酸激酶在植物耐旱性中的重要作用,可以认为玉米丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶2C基因ZmPP2Cα,与玉米对干旱胁迫的应答有关。在同样的干旱胁迫条件下,叶片中丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶2C（PP2C）的活性变化检测结果表明,“81565”、“N87-1”和“R09”三个耐旱自交系随干旱处理时间的延长,叶片中的PP2C酶活性降低;不耐旱自交系“200B”和“ES40”随干旱处理时间的延长,叶片中的PP2C酶活性呈现先降低后回升的趋势;不耐旱自交系“丹340”在干旱胁迫下,叶片中的PP2C酶活性总体略有升高。综上所述,ZmPP2Ca基因的差异表达以及由此引起的PP2C酶活性差异,可能与干旱胁迫条件下玉米细胞的信号传导有关,进一步深入研究有可能开发为基因内选择标记,为耐旱性分子标记辅助选择提供有用信息。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 一 文献综述
• 1 高等植物的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶2C
• 1.1 蛋白可逆磷酸化在生物信号传递中的作用
• 1.2 蛋白磷酸酶的分类
• 1.3 PP2C的理化性质
• 1.4 PP2C基因及其蛋白质结构特征
• 1.5 PP2C在高等植物中的功能与作用
• 1.5.1 PP2C参与脱落酸（ABA）信号途径
• 1.5.1.1 PP2C参与ABA调控的种子休眠/萌发信号途径
• 1.5.1.2 PP2C参与ABA调控的气孔关闭信号转导途径
• 1.5.1.3 PP2C参与ABA调控的抗逆信号转导途径
• 1.5.2 PP2C参与植物创伤信号途径
• 1.5.3 PP2C参与植物的发育
• 1.5.4 PP2C参与植物的抗病信号途径
• 1.5.4.1 PP2C作为转录因子作用
• 1.5.4.2 PP2C在植物细胞壁修饰中的作用
• 2 实时荧光定量PCR
• 2.1 实时荧光定量PCR原理
• 2.2 定量理论
• 2.2.1 理论模式
• 2.2.2 绝对定量和相对定量
• 2.3 实时荧光定量PCR常见方法
• 2.3.1 荧光嵌合法（SYBR Green Ⅰ法）
• 2.3.2 荧光探针法
• 2.4 实时荧光定量PCR在植物研究中的应用
• 3.蛋白磷酸酶活性测定原理
• 4.本研究的目的及意义
• 二 材料与方法
• 1 ZmPP2Cα基因mRNA表达量测定
• 1.1 材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 载体与菌株
• 1.1.3 主要试剂和试剂盒
• 1.1.4 主要仪器与耗材
• 1.1.5 所用溶液及其配制
• 1.1.5.1 RNA提取试剂的配制
• 1.1.5.2 基因组DNA提取试剂的配制
• 1.1.5.3 克隆试剂的配制
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 ZmPP2Cα基因在干旱胁迫下的表达特性
• 1.2.1.1 材料培养与干旱处理
• 1.2.1.2 玉米叶片总RNA的提取
• 1.2.1.3 引物设计
• 1.2.1.4 cDNA第一链合成
• 1.2.1.5 实时荧光定量PCR引物的特异性检测
• 1.2.1.6 定量标准品的制备
• 1.2.1.7 FQ-PCR反应及分析
• 1.2.1.8 统计分析
• 2.ZmPP2C α酶活性测定
• 2.1 材料
• 2.1.2 主要试剂,试剂盒及仪器
• 2.1.3 所用溶液及其配制
• 2.1.3.1 PP2C酶抽提buffer的配制
• 2.1.3.2 反应buffer的配制
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 反应缓冲液各组分兼容性测定
• 2.2.2 酶液提取
• 2.2.3 酶活标准曲线制作
• 2.2.4 酶活测定
• 三 结果与分析
• 1 ZmPP2Ca基因在干旱胁迫条件下的差异表达
• 2 酶活测定结果
• 四 讨论
• 1 材料的干旱处理
• 2 RNA的制备与检测
• 3 内参基因的选择
• 4 定量PCR实验中应该注意的几个问题
• 5 ZmPP2C α基因在干旱胁迫下的表达模式
• 6 PP2C酶活性与耐旱性的关系
• 参考文献
• 致谢
• 附录1 分子生物学常用方法
• 附录2 攻读硕士学位期间发表的学术论文