Der p2重组BCG对哮喘小鼠气道炎症的抑制作用及其机制的研究

论文摘要

哮喘是一种以可逆性气道阻塞、嗜酸性粒细胞性气道炎症、气道高反应性和气道重塑为特征的慢性气道疾病。抗原特异性CD4+ Th2细胞产生的大量IL-4、IL-5和IL-13等细胞因子直接导致了哮喘的各种病理生理改变。此外,哮喘的发病与环境变应原诱导的速发型超敏反应直接相关。其中,屋尘螨抗原是最重要的诱发哮喘的室内变应原。构建变应原重组免疫调节疫苗,转变有害的变应性Th2免疫应答为保护性免疫应答、进而改变哮喘疾病进程、从而获得满意长期疗效的治疗策略是哮喘基础和临床研究的一个重要方向。我们课题组前期构建了胞壁表达屋尘螨抗原Der p2的重组BCG疫苗（Der p2 recombined BCG）。随后的研究证实,该rBCG可诱导naive小鼠发生Th2向Th1方向的免疫偏移。但是,Der p2 rBCG在小鼠哮喘模型中的免疫调节作用仍不清楚。BCG是广泛应用的Th1应答诱导疫苗。几项研究表明BCG可通过诱导Th2向Th1方向的免疫偏移治疗哮喘等变应性疾病。但是近年来有研究认为分枝杆菌下调哮喘气道炎症与其作为免疫佐剂诱导生成Tregs有关,而与免疫偏移无关。因此,BCG/rBCG抑制哮喘气道炎症的免疫学机制有待进一步的研究。Notch是一条高度保守的调控细胞增殖和分化的信号通路。Notch配体和受体之间的相互作用可以触发受体释放胞内段NIC进入胞浆。NIC转位至核内并与转录因子RBP-J结合。RBP-J进一步调控Hes家族分子等下游基因的表达。Hes蛋白是抑制性bHLH分子,可抑制许多bHLH家族分子的表达。Notch信号调控着T细胞发育多个阶段的谱系决定过程。有研究提示Notch信号参与了Tregs的分化过程。但是Notch信号在nTregs的发育和功能维持中具体作用仍不清楚。Foxp3是调控nTregs发育和功能的关键分子。Notch信号是否可以直接调控Foxp3的表达及其机制如何仍不清楚。本研究的目的是:（1）观察Der p2 rBCG对哮喘小鼠气道炎症的抑制作用并探讨其免疫学机制;（2）观察Notch信号对Foxp3表达的调控作用并阐明其调控机制。其主要研究成果如下: 1.证实了在OVA及Der p2两种变应原诱导的哮喘小鼠模型中,Der p2 rBCG免疫可以下调气道局部的炎症细胞浸润,肺组织病理形态学改变,粘液高分泌及肥大细胞脱颗粒现象。对BALF中Th2类细胞因子表达谱的检测分析表明Der p2 rBCG减少了IL-4、IL-5和IL-13的产生。所以,Der p2 rBCG可以有效下调哮喘变应性Th2免疫应答。2.通过对哮喘小鼠BALF中IFN-γ/IL-4及肺组织中IFN-γ/IL-4 mRNA的分析,发现Der p2 rBCG免疫可诱导哮喘小鼠发生Th2向Th1方向的免疫偏移,改变气道局部及全肺组织中的Th2细胞因子极化环境。3.发现Der p2 rBCG上调了Der p2诱导的哮喘小鼠BALF中TGF-β的水平;Der p2 rBCG免疫增加了小鼠脾脏中CD4+CD25+Foxp3+ T细胞的相对比例和绝对数量;Der p2 rBCG诱导产生的CD4+CD25+ T细胞可以在体外以抗原特异性的方式抑制效应CD4+ T细胞的增殖;过继转移Der p2 rBCG诱导产生的CD4+CD25+ T细胞可定向迁移至受体哮喘小鼠胸腔局部引流淋巴结下调气道局部炎症。因此,Der p2 rBCG对哮喘气道炎症的下调作用也与其诱导的Tregs介导的免疫抑制有关。4.通过生物信息学分析发现在小鼠和人FOXP3启动子中均存在假定的RBP-J结合位点和Hes结合位点。进一步通过报告基因实验证实了异位过表达NIC可以增强FOXP3启动子活性。DNA pull-down实验表明NIC-RBP-J复合物可以与FOXP3启动子中的RBP-J结合位点结合。GSI阻断Notch信号后CD4+CD25+ Tregs中Foxp3的表达下调。因此,Notch信号可以直接调控Foxp3的表达。但ChIP分析表明在CD4+CD25- T细胞中NIC-RBP-J复合物也与FOXP3启动子结合在一起,提示Notch信号并没有参与Tregs发育的谱系形成过程。5.构建了一系列RBP-J结合位点和N-box位点的截短及点突变的报告基因质粒。通过报告基因发现,NIC-RBP-J复合物是FOXP3启动子的反式激活因子,而Hes1是反式阻遏因子。Western blot证实在高剂量NIC下调FOXP3启动子活性时,Hes1被诱导表达。因此,Notch信号以双相性的方式调节FOXP3启动子的活性:低水平的Notch信号通过NIC-RBP-J复合物增强FOXP3启动子活性,而高水平的Notch信号通过Hes1下调了FOXP3启动子活性。6.通过ChIP实验发现Hes1仅在CD4+CD25- T细胞中与FOXP3启动子结合,在Tregs中anti-Hes1并不能沉淀出FOXP3启动子中的相应染色质片断。同时,点突变报告基因实验表明Hes1对FOXP3启动子活性有显著的抑制作用。所以Hes1可能是Tregs发育的谱系决定过程中转录因子水平的一个重要调控因子。综上所述,我们证实了自行构建的Der p2 rBCG可以有效下调哮喘变应性Th2免疫应答,其介导的免疫调节过程同时涉及了免疫抑制和免疫偏移两种机制。这些发现提供了又一个可行的哮喘免疫调节治疗方法,并在一定程度上丰富了哮喘免疫学发病机制。我们还发现Notch信号通路可以通过RBP-J和Hes1依赖的机制双相性的直接调控FOXP3启动子活性,Hes1可能是Tregs发育的谱系决定过程中转录因子水平的一个重要调控因子。这部分研究结果为nTregs的发育分化机制研究提供了一条新的重要线索,并在一定程度上丰富了Notch信号调控淋巴细胞发育方面的基本理论。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 文献回顾
• （一） 哮喘的免疫学发病机制
• （二） Tregs
• （三） Tregs 在哮喘发病中的作用
• （四） 基于免疫偏移策略的哮喘免疫治疗
• （五） 基于免疫抑制策略的哮喘免疫调节治疗
• （六） BCG 及 rBCG 在哮喘防治中的作用
• 正文
• 实验一 Der p2 rBCG对哮喘小鼠气道炎症的抑制作用及其机制
• 一 材料和主要仪器
• 二 方法
• 三 结果
• 四 讨论
• 实验二 Notch通过RBP-J-和He51-依赖的方式调控FOXP3 启动子活性
• 一 材料和主要仪器
• 二 方法
• 三 结果
• 四 讨论
• 小结
• 参考文献
• 个人简历和研究成果
• 致谢