镉胁迫下平邑甜茶根系细胞死亡及其中介因素研究

论文摘要

本文以当年生平邑甜茶实生苗为试验材料,通过200μmol/L硫酸镉处理根系,利用透射电镜、琼脂糖凝胶电泳、吖啶橙荧光染色、类Caspase3/7活性检测和流式细胞仪分析等技术和方法,研究了镉胁迫下根系细胞程序性死亡（programmed cell death, PCD）及处理过程中根系线粒体特性变化,并且探讨了活性氧、一氧化氮、多胺和钙离子在此过程的作用。结果表明：1.200μmol/L硫酸镉使平邑甜茶根系线粒体膜通透性（MPT）增大、膜电位（△Ψm）和细胞色素c （cytochrome c, Cyt c）含量逐渐下降,同时导致细胞染色质凝聚、趋边聚集,DNA片段化等程序性死亡特征出现；随着硫酸镉处理时间的延长,根系类Caspase3/7活性、细胞凋亡率以及细胞死亡数量均逐渐增加。2.镉胁迫下,根系通过积累活性氧而促进细胞程序性死亡。短时间的镉胁迫引起平邑甜茶根系超氧阴离子产生速率和过氧化氢含量的急剧升高,之后随着胁迫时间的延长,二者有所下降但仍显著高于对照,与此相伴随的是根系细胞死亡数量和细胞凋亡率也高于对照。活性氧清除剂抗坏血酸和过氧化氢酶降低了镉胁迫下超氧阴离子产生速率和过氧化氢的水平,抑制了镉胁迫下MPT的增加和△Ψm、Cyt c含量的降低,降低了镉胁迫下根系细胞死亡数量和细胞凋亡率。3.镉胁迫下,根系NO的变化和其对细胞死亡的作用与活性氧类似；NO能够通过提高线粒体的通透性和激活Caspase而促进硫酸镉诱导的根系细胞程序性死亡。在镉胁迫初期,根系NO生成速率急剧增加,之后随着胁迫时间的延长,NO生成速率减少,但仍显著高于对照。NO供体SNP提高了镉胁迫下根系内源NO水平,促进了镉胁迫下根系线粒体MPT的增加和△Ψm、Cyt c含量的降低,提高了镉胁迫下根系细胞死亡数量、Caspase-like3/7的活性和根细胞凋亡率；而NOS抑制剂AG、NR抑制剂NaN3和NO清除剂cPTIO则降低了镉胁迫下根系NO的生成水平,对镉胁迫下根系MPT的增加和△Ψm、Cyt c含量的降低也有抑制作用,还降低了镉胁迫下根系细胞死亡数量、Caspase-like3/7的活性和根细胞凋亡率。4.镉胁迫下根系一氧化氮的产生与活性氧的生成相互促进。抗坏血酸和过氧化氢酶降低了镉胁迫下根系NO水平的提高；NO供体SNP提高了镉胁迫下根系超氧阴离子产生速率和过氧化氢含量；NOS抑制剂AG、NR抑制剂NaN3和NO清除剂cPTIO抑制了镉胁迫下根系超氧阴离子产生速率和过氧化氢含量的提高。5.多胺能够调节硫酸镉胁迫下根系细胞程序性死亡。镉胁迫下平邑甜茶根系游离腐胺含量急剧增加,而精胺和亚精胺含量则下降。外源精胺和亚精胺明显降低了镉胁迫下腐胺的积累,提高了内源精胺和亚精胺水平,抑制镉胁迫下根系MPT、H2O2含量的增加以及△Ψm、Cyt c含量的降低,同时也降低了镉胁迫下根系细胞死亡数量、Caspase-like3/7的活性和根系细胞凋亡率。在镉处理早期,根系多胺氧化酶（PAO）活性急剧升高,6h时达到最高值,之后随着胁迫时间的延长而逐渐下降,但仍保持在较高的活力水平,与H202含量变化相一致；单独使用外源精胺和亚精胺可提高非胁迫时根系PAO活性和H202含量,但抑制了镉胁迫下PAO活性和H202含量的升高。6.镉胁迫下根系NO的生成和多胺的积累相互影响。外源NO使镉胁迫下平邑甜茶根系精胺和亚精胺含量进一步降低,NOS抑制齐AG、NR抑制剂NaN3和NO清除剂cPTIO均阻止镉胁迫下根系精胺和亚精胺含量的下降。外源精胺和亚精胺能够提高非胁迫时根系根系NO生成速率、NOS活性和NR活性,但抑制镉胁迫引起的NO生成速率的升高。7.钙离子参与调节硫酸镉胁迫下根系细胞程序性死亡,其作用效果因钙离子浓度而异。低浓度的钙离子（5 mmol/L和10mmol/LCaCl2）阻止了镉胁迫下根系△Ψm和Cytc含量的下降以及MPT、H2O2含量的升高,减少了根系细胞凋亡率,10 mmol/L比5 mmol/L的CaCl2效果更明显；高浓度的钙离子（50 mmol/LCaCl2）加剧了镉胁迫下根系MPT的增大、H202含量的升高、ΔΨm的减小和Cyt c含量的降低,促进了根系细胞程序性死亡。钙离子螯合剂EGTA、钙调素抑制剂CPZ和钙离子通道抑制剂LaCl3对镉胁迫下根系MPT、H2O2含量的升高和△Ψm、Cytc含量的降低具有抑制作用,同时也降低了根细胞凋亡率；Ca2+-ATP酶的抑制剂Van促进镉胁迫下根系MPT、H2O2含量的增加和ΔΨm、Cyt c含量的降低,也促进了根系细胞程序性死亡。

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Abstract

1 前言

1.1 植物镉胁迫研究进展

1.1.1 土壤镉污染及其环境危害

1.1.2 镉胁迫对植物根系的伤害

1.1.3 果树对镉胁迫的反应

1.2 植物细胞程序性死亡

1.2.1 植物细胞程序性死亡的类型与特征

1.2.1.1 植物细胞程序性死亡的类型

1.2.1.2 植物细胞程序性死亡的特征

1.2.2 植物细胞程序性死亡的发生机制

1.2.3 植物细胞程序性死亡的生物学意义

1.2.4 果树细胞程序性死亡的研究进展

1.3 本研究的目的和意义

2 材料与方法

2.1 材料

2.2 试验处理

2.2.1 镉胁迫处理

2.2.2 活性氧在硫酸镉诱导根系死亡中的作用

2.2.3 一氧化氮在硫酸镉诱导根系死亡中的作用

2.2.4 精胺和亚精胺在硫酸镉诱导根系死亡中的作用

2.2.5 钙离子在硫酸镉诱导根系死亡中的作用

2.3 试验方法

2.3.1 根系细胞死亡数量测定

2.3.2 电镜样品制备与观察

2.3.3 过氧化氢含量测定

2.3.4 超氧阴离子产生速率测定

2.3.5 一氧化氮生成速率的测定

2.3.6 一氧化氮合酶活性的测定

2.3.7 硝酸还原酶活性的测定

2.3.8 多胺含量测定

2.3.9 多胺氧化酶活性的测定

2.3.10 线粒体的提取

2.3.11 线粒体膜通透性的检测

2.3.12 线粒体膜电位测定

2.3.13 线粒体细胞色素c/a测定

2.3.14 类Caspases3/7蛋白酶活性检测

2.3.15 DNA提取和琼脂糖凝胶电泳检测

2.3.16 根细胞凋亡率FCM测定

2.3.17 吖啶橙染色观察

3 结果与分析

3.1 硫酸镉胁迫下平邑甜茶根系细胞死亡特征

3.1.1 镉胁迫下根系细胞死亡数量的变化

3.1.2 镉胁迫下延长根细胞超微结构的变化

3.1.3 镉胁迫下根系线粒体特性的变化

3.1.4 镉胁迫下根系类Caspase 3/7蛋白酶活性的变化

3.1.5 镉胁迫对根系细胞核DNA的影响

3.1.6 硫酸镉胁迫下根系细胞凋亡率的变化

3.2 活性氧在硫酸镉诱导的平邑甜茶根系死亡中的作用

3.2.1 镉胁迫下根系活性氧生成的变化

3.2.2 抗坏血酸和过氧化氢酶对镉胁迫下根系活性氧生成的影响

3.2.3 抗坏血酸和过氧化氢酶对镉胁迫下根系细胞死亡数量的影响

3.2.4 抗坏血酸和过氧化氢酶对镉胁迫下根系线粒体特性的影响

3.2.5 抗坏血酸和过氧化氢酶对镉胁迫下根系细胞凋亡率的影响

3.2.6 抗坏血酸和过氧化氢酶对镉胁迫下根系NO生成速率的影响

3.2.7 抗坏血酸和过氧化氢酶对镉胁迫下根系多胺含量的影响

3.3 一氧化氮在硫酸镉诱导的平邑甜茶根系死亡中的作用

3.3.1 镉胁迫下根系一氧化氮合成代谢的变化

3.3.2 外源一氧化氮对镉胁迫下根系一氧化氮合成代谢的影响

3.3.3 外源一氧化氮对镉胁迫下平邑甜茶根系细胞死亡数量的影响

3.3.4 外源一氧化氮对镉胁迫下根系线粒体特性的影响

3.3.5 外源一氧化氮对镉胁迫下根系类Caspase3/7活性的影响

3.3.6 外源一氧化氮对镉胁迫下根系细胞凋亡率的影响

3.3.7 外源一氧化氮对镉胁迫下根系活性氧生成的影响

3.3.8 外源一氧化氮对镉胁迫下根系游离多胺的影响

3.4 多胺在硫酸镉诱导的平邑甜茶根系死亡中的作用

3.4.1 镉胁迫下根系游离多胺代谢的变化

3.4.2 外源精胺和亚精胺对镉胁迫下根系内源多胺代谢的影响

3.4.3 外源精胺和亚精胺对镉胁迫下根系细胞死亡数量的影响

3.4.4 外源精胺和亚精胺对镉胁迫下根系线粒体特性的影响

3.4.5 外源精胺和亚精胺对镉胁迫下根系类Caspsae3/7活性的影响

3.4.6 外源精胺和亚精胺对镉胁迫下平邑甜茶根系细胞凋亡率的影响

3.4.7 外源精胺和亚精胺对镉胁迫下根系过氧化氢含量的影响

3.4.8 外源精胺和亚精胺对镉胁迫下根系一氧化氮合成代谢的影响

3.5 钙在硫酸镉胁迫下平邑甜茶根系死亡中的作用

3.5.1 钙对镉胁迫下根系细胞死亡数量的影响

3.5.2 钙对镉胁迫下根系线粒体特性的影响

3.5.3 钙对镉诱导的根系类Caspase 3/7活性的影响

3.5.4 钙对镉诱导的根系细胞凋亡率的影响

3.5.5 钙对镉胁迫下平邑根系根系活性氧生成的影响

3.5.6 钙对镉胁迫下根系一氧化氮生成速率的影响

3.5.7 钙对镉胁迫下根系游离多胺含量的影响

4 讨论

4.1 硫酸镉胁迫下平邑甜茶根系细胞逐渐由凋亡发展到死亡

4.2 活性氧在硫酸镉诱导的根系PCD中的作用

4.3 一氧化氮在硫酸镉诱导的根系PCD中的作用

4.3.1 一氧化氮的产生途径

4.3.2 一氧化氮与硫酸镉诱导的根系程序性死亡

4.4 多胺在硫酸镉诱导的根系PCD中的作用

4.5 线粒体在硫酸镉诱导的根系PCD中的作用

4.6 钙离子在硫酸镉诱导的根系PCD中的作用

5 结论与创新点

5.1 结论

5.2 创新点

图版Ⅰ

参考文献

致谢

攻读博士学位期间发表和投寄的论文

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