论文摘要
目的革兰阴性菌（Gram-negative bacterial，GNB）感染败血症、内毒素血症及休克的临床病死率很高，是住院患者死亡的重要原因，也是抗感染治疗的一大难题。细菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是GNB的关键因子，具有双重功能：一方面，LPS是造成GNB败血症的真正原因；而另一方面，适量的LPS又可增强机体的非特异性免疫功能，诱导机体的内毒素耐受。本研究尝试应用GNB临床分离的多重耐药株的LPS，制备相应的LPS脂质体主动免疫小鼠，以寻求有效预防医院内多重耐药菌感染的新方法。方法酶法提取GNB临床分离耐药株的LPS，按照LPS／磷脂（Wt）为1：10的比例，运用逆向蒸发法将LPS与磷脂-胆固醇贮存液（PC：PS：Chol摩尔比例为4：1：4）制备成LPS脂质体。以鲎变形细胞溶解物试验（Limulus Amebocyte lysate test，LAL，以下简称鲎试验）分别测定游离LPS和LPS脂质体的内毒素活性以评价脂质体的包封率，激光散射法分析其粒径分布，透射电镜观察其形态。建立半乳糖胺（D-GalN）小鼠模型，以LPS脂质体进行主动免疫后，观察同一菌株LPS、同一菌种不同菌株LPS及不同菌种LPS攻击小鼠的致死性试验结果。结果根据Dijkstra等人采用的逆向蒸发法[磷脂（PC：PS：Chol）的摩尔比例为4：1：4，LPS／磷脂（wt）为1：10]制备的不同菌种LPS脂质体常温下呈乳白色混悬液，透射电镜下，呈规则的球形，粒径分布均匀，直径在300-600nm与未经脂质体包被的同种LPS相比，LPS脂质体的内毒素活性降低了102-103倍。由此推算出经逆向蒸发法所制各的LPS脂质体的包封率在99-99.9％。在为期90天的稳定性试验中，所有样品无论在常规条件（4℃）下还是在加速条件（37℃）下，在任何时间点均未发生LAL活性的改变。于30天取样进行电镜观察，脂质体形态无明显变化，粒径分析仅显示有粒径的轻度增加。LPS脂质体在剂量相当大时无明显的致热原性，且不引起动物的中毒反应（如体重下降、昏睡或交替呼吸等）。Pa5脂多糖脂质体（Pa5-L-LPS，以下同）免疫后，小鼠无论是接受铜绿假单胞菌属的LPS还是全菌攻击，试验组的生存率和生存时间均高于对照组（p＜0.05）；同菌种之间并无统计学差异。与其他菌属细菌攻击的试验组相比，无论是LPS还是全菌攻击，铜绿假单胞菌属攻击的试验组生存率和生存时间均显著高于大肠杆菌属攻击的试验组（p＜0.05），但其生存率与克雷伯菌属攻击的试验组间并无显著性差异，仅可相对延长后者的生存时间（p＜0.05）。E5-L-LPS免疫后，小鼠无论是接受大肠杆菌属LPS还是全菌攻击，试验组与对照之间存在生存率和生存时间的统计学差异（p＜0.05），接受铜绿假单胞菌的LPS和克雷伯菌属LPS攻击时，生存率无显著性变化，但试验组的生存时间明显延长（p＜0.05）。结论本试验初步确立了GNB LPS脂质体的实验室制备方法，并对其形态、粒径、LAL活性、包封率、稳定性、热原性及对动物的毒性和免疫保护性作用等进行了多方面的考察，结果提示LPS脂质体在适宜条件下长期贮存基本稳定，无毒、无热原性，并对多种GNB及其LPS具有保护性作用，有望成为主动预防医院内获得性感染、减少LPS介导的一系列并发症的新型疫苗。