DOC-1基因在口腔鳞癌中的表达差异及p12DOC-1外源性表达对Tca8113细胞的影响

论文摘要

口腔癌是口腔颌面部最常见的肿瘤,其发病部位位于体表或接近体表部位,故严重影响患者正常的生理功能及社会交往。随着分子生物学技术的迅速发展,许多疾病的发生、发展都已经从基因水平上得到相应的解释。癌基因与抑癌基因的突变、失活、表达异常是癌症发生的主要原因,近年来一些与口腔癌相关的基因被相继发现,为从分子水平上研究口腔癌的发生、发展提供了可能。口腔癌缺失基因1（deleted in oral cancer-1, DOC-1）是哈佛大学Todd于1995年在仓鼠口腔上皮中发现的一个候选抑癌基因,p12蛋白是该基因编码的蛋白产物,研究发现p12蛋白具有抑制肿瘤生长的功能。人类DOC-1位于染色体12q24,cDNA全长为1627bp,编码115个氨基酸,蛋白产物分子量为12.4kDa。目的本课题组前期研究发现,不同分化程度的口腔鳞癌中p12蛋白的表达量有差异,本课题研究的目的是通过半定量RT-PCR的方法,来观察DOC-1基因在不同分化程度的口腔癌中mRNA的表达含量是否有区别。构建DOC-1基因ORF编码区的真核表达载体,转染舌癌Tca8113细胞株,观察外源性表达的p12蛋白对舌癌Tca8113细胞的生物学行为的影响。方法1.通过设计特异性引物,采用RT-PCR的方法检测口腔鳞状细胞癌和正常口腔粘膜组织中DOC-1基因mRNA的表达。所得产物电泳后经计算机凝胶成像系统测定每个产物的灰度值,通过与内参照的灰度值进行对比得到每个产物的一个相对值,再对得到的相对值进行统计学分析。2.设计针对人DOC-1基因ORF编码区的引物,从HaCaT（人永生化表皮细胞）中克隆出ORF编码区序列,在序列两端连入相应的特异性酶切位点,经酶切、连接、转化、测序,成功构建含有DOC-1基因ORF编码区的真核表达载体。3.将构建好的含有DOC-1基因ORF编码区的真核表达载体通过转染试剂盒转染舌癌Tca8113细胞株,稳定转染后测定转染前后细胞增殖能力和细胞侵袭能力,观察外源性表达的p12蛋白对舌癌Tca8113细胞的生物学行为的影响。结果1. DOC-1基因mRNA在口腔癌中的灰度值为1.22±0.12,在口腔粘膜中的灰度值为1.58±0.15;DOC-1 mRNA在高分化口腔癌中的灰度值为1.35±0.04,在中分化口腔癌中的灰度值为1.20±0.05,在低分化口腔癌中的灰度值为1.08±0.03。2.构建好的载体经双酶切、电泳、测序鉴定,表明含有DOC-1基因ORF编码区的真核表达载体pEGFP-N1-DOC-1构建成功。3.筛选出的稳定转染细胞与对照组细胞比较,细胞增殖能力降低,细胞侵袭转移能力也降低,且与对照组细胞相比,改变具有显著性。结论本实验证实了DOC-1基因mRNA的表达量在不同分化程度的口腔鳞癌中有差异,口腔鳞癌分化程度越低,DOC-1基因mRNA的表达量也越低。DOC-1基因可能在口腔鳞状细胞癌早期具有重要作用,DOC-1基因mRNA的低表达可能是口腔鳞状细胞癌中的早期事件。成功构建了含有DOC-1基因ORF编码区的真核表达载体pEGFP-N1-DOC-1,转染舌癌Tca8113细胞得到稳定转染,稳定转染组细胞增殖能力降低,细胞侵袭转移能力也降低,且与对照组细胞相比,改变具有显著性差异。质粒载体DNA稳定转染,可能通过与宿主染色体发生整合,引起转染细胞生物学性状改变。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 文献回顾
• 一、口腔癌临床研究进展
• 二、口腔癌发病分子机制的研究新进展
• DOC-1研究进展'>三、DOC-1 基因和p12^DOC-1研究进展
• 正文
• 实验一 DOC-1 基因在口腔鳞癌和口腔粘膜中的表达
• 1 材料和仪器设备
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 实验二 两种人源性DOC-1 基因真核表达重组质粒的构建及表达
• 1 材料与仪器设备
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 实验三 编码p12 蛋白质粒的转染对Tca8113 细胞生物学行为的影响
• 1 材料与仪器设备
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 小结
• 参考文献
• 附图
• 个人简历和发表文章
• 致谢