论文摘要
研究背景:心血管疾病（cardiovascular disease,CVD）是危害人类健康的严重疾病,具有“发病率高,死亡率高,致残率高,复发率高”以及“并发症多”的特点。近年来CVD的死亡率仍居世界前列,达世界死亡人数的20%,特别是45岁以上男性,65岁以上女性极易出现心血管症状,如心肌梗塞,高血压,心衰,冠心病等,尤其是近年来发病年龄的年轻化,对人们的健康造成极大威胁。过去CVD被认为属于血流动力学紊乱的范畴,近年来的治疗政策逐渐转向对疾病发展的控制,最近研究认为,活性氧（reactive oxygen species,ROS）可能是CVD发生、发展的重要参与者,ROS可导致心血管功能失调,细胞凋亡和坏死,内源性抗氧化系统破坏,脂质与蛋白代谢与功能的改变,信号转导改变,基因表达改变等。因此理论上说抗氧化治疗对CVD有很大价值。阿霉素（Doxorubicin,DXR or DOX）属蒽醌类抗肿瘤抗生素,具有抗瘤谱广、作用强的特点,在临床上广泛用于治疗白血病、淋巴瘤等多种恶性肿瘤,因此是目前最常用的抗肿瘤药物之一,但长期应用可以发生剂量依赖性心脏毒性。用药早期即可出现各种心律失常,晚期出现剂量依赖性充血性心力衰竭,表现为不可逆的慢性心肌改变。与其他抗肿瘤药如环磷酰胺、博莱霉素、顺铂等合用时,其心脏毒性进一步加重,一旦心力衰竭发生,其病死率可达33%～70%,因而大大限制了其在临床上的应用。近年来国内外的研究表明,阿霉素的心脏毒性作用主要与以下几个方面有关:①自由基代谢异常;②钙超载;③核酸、蛋白质合成的抑制;④能量代谢障碍。这些机制相互影响,共同作用,尤其是自由基代谢异常和钙超载,与其他机制均有着密切的关系,在阿霉素的心脏毒性作用尤其是诱导心肌细胞凋亡的发生发展中发挥着关键的作用。ROS主要由线粒体电子转移、免疫细胞渗入和氧化酶（Xanthine oxidase,NADH/NADPH oxidase,Nitric oxide synthesis）诱导等过程产生,进一步导致心肌细胞凋亡与坏死,内源性抗氧化防御系统破坏,脂质与蛋白代谢与功能的改变,信号转导通路改变及基因表达改变,胞内Ca2+超载等,形成恶性循环。细胞内钙超载被认为是细胞凋亡的始动因素。钙超载又能增加ROS合成,引起细胞自由基损伤。所以说心肌细胞发生脂质过氧化和细胞内钙超载这两个因素相互关联,是心血管疾病和阿霉素心肌毒性作用发生的关键机制。中药作用范围广,毒副作用少,能有效地清除氧自由基抗脂质过氧化和调节钙离子稳定,从而保护心血管系统及阿霉素所致心肌细胞损伤。因此,从天然植物中寻找新型、高效、低毒的,具有多靶位调节作用的防治药物仍是药学研究的重点之一。我国有着丰富的植物资源,岩青兰（Dracocephalum rupestre Hance）又名毛建草,为多年生草本植物,广泛分布于我国辽宁、内蒙、河北、山西、青海等地。全草药用可清热消炎、凉血止血,主治外感风热、头痛寒热、喉痛咳嗽、黄疸性肝炎、吐血衄血、痢疾以及外感夹食、胸脘胀满、消化不良等。其地上全草所含总黄酮给麻醉犬静脉滴注可以有效缓解急性心肌缺血,同时缩小犬急性心肌梗死面积;犬冠脉流量明显增加。为了寻找对心肌细胞有保护作用的有效成分,开发利用该植物资源,本教研室对该植物地上全草进行了系统的化学成分研究,共分离得到多个黄酮类化合物及其苷类化合物。氧化损伤是心血管疾病和阿霉素心肌损伤的机制之一,故研究药物的抗氧化分子机制,对于揭示药物治疗心血管疾病和阿霉素心肌损伤具有重要意义。在心肌细胞上表达的抗氧化调节基因和蛋白主要有Nrf2,AREs,ERK1/2等。介导细胞氧化还原反应的信号转导通路主要是和Nrf2/ARE和MAP激酶信号转导通路。Nrf2在细胞浆中与胞浆骨架蛋白-1（cytoskeletal protein 1,Keap 1）结合而呈失活状态,Nrf2在细胞浆中磷酸化后转位到细胞核,相应于PKC和MAP激酶途径。在细胞核中,Nrf2通过与bZIP家族的转录因子包括CREB、ATF4、fos或jun结合而激活AREs,从而调节二相酶GST-A2,NQO-1,HO-1,GCL,epoxidehydrolase,和UDP-glucuronosyl transferase等的表达。此过程被小maf蛋白包括MafG和MafK所拮抗。另外,心肌细胞凋亡是导致阿霉素性心肌病的主要原因。氧化损伤和钙超载均能导致心肌细胞凋亡,凋亡通路中Bcl-2和Caspase家族发挥着重要作用。所以药物可以从保护氧化损伤、降低钙超载、作用于通路中的某个环节或通过作用于多个靶点而保护心肌细胞。本实验通过体外心肌细胞培养,以阿霉素造成心肌损伤模型,观察岩青兰黄酮对阿霉素诱导的心肌损伤的保护作用,并进一步探讨其分子机制,主要研究柚皮素-7-O-葡萄糖苷的抗氧化机制和抗心肌细胞凋亡机制,分析阿霉素心肌损伤的发病机制中多个机制尤其是氧自由基和钙超载以及最终引起心肌细胞凋亡之间的相互关系和交叉点,并进一步从分子水平上阐明该类化合物心肌保护作用的分子靶点,对开发新的心血管药物和减少阿霉素的心脏毒性提高其临床应用的安全性具有重要的理论和实践意义。实验方法:1.用MTT法对5种岩青兰黄酮的药理活性进行初步的筛选,观察其不同剂量（2.5、5、10、20、40、80μM）对正常心肌细胞和损伤的心肌细胞的增殖作用的影响,检测正常心肌细胞、阿霉素（20μM）损伤的心肌细胞、及加入岩青兰黄酮（2.5、5、10、20、40、80μM）作用的各组心肌细胞吸光度。观察柚皮素-7-O-葡萄糖苷（10、20、40、80μM）对阿霉素（20μM）损伤的心肌细胞活力影响的时效关系,应用试剂盒检测柚皮素-7-O-葡萄糖苷（10、20、40μM）对心肌细胞内抗氧化酶SOD、CAT、GSH及GSH-Px的水平和MDA的含量的影响。2.不同剂量柚皮素-7-O-葡萄糖苷（10、20、40μM）对阿霉素（10μM）诱导的心肌细胞凋亡情况检测:1)瑞氏-吉姆萨和Heochst33258染色后,分别于倒置显微镜和荧光显微镜下观察正常、凋亡、加药保护的各组细胞的形态。2)琼脂糖凝胶电泳分析（DNA ladder）;3)流式细胞仪分析-磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V/PI双染法）;4)RT-PCR检测心肌细胞Caspase-3,Caspase-9,Bcl-2和HO-1 mRNA的表达;5)Western blot检测Bcl-2,HO-1的蛋白表达;6)用Fura-2/AM钙荧光探针测定细胞内钙离子浓度。3.不同剂量柚皮素-7-O-葡萄糖苷（10、20、40μM）对内源性抗氧化酶的诱导作用:1)RT-PCR检测柚皮素-7-O-葡萄糖苷对心肌细胞GCLM、GCLC和NQO1 mRNA的表达;2)Western blot检测柚皮素-7-O-葡萄糖苷对NQO1的蛋白表达;3)Western blot检测柚皮素-7-O-葡萄糖苷对Nrf2的核转位和磷酸化ERK1/2表达的影响。结果:1.通过用MTT法对5种岩青兰黄酮（北美圣草素、北美圣草素-7-O-葡萄糖苷、木犀草素、柚皮素-7-O-葡萄糖苷及化合物6）的心肌细胞保护作用进行初步的筛选发现,低剂量（2.5、5、10、20、40μM）的岩青兰黄酮对正常心肌细胞的增殖无明显影响,随着剂量增加,表现出对心肌细胞的增殖有抑制作用;阿霉素损伤的心肌细胞的增殖作用明显下降。低剂量（2.5、5、10、20、40μM）岩青兰黄酮对阿霉素损伤的心肌细胞有不同程度的保护作用,其中柚皮素-7-O-葡萄糖甘的保护作用较好。柚皮素-7-O-葡萄糖苷能提高阿霉素损伤的心肌细胞内GSH水平,降低MDA含量,并增强SOD、CAT和GSH-Px的活性,从而对阿霉素诱导的心肌损伤有一定保护作用。2.柚皮素-7-O-葡萄糖苷（10、20、40μM）能保护阿霉素（10μM）诱导的心肌细胞凋亡:1)形态学观察:瑞氏-吉姆萨和Hoechst33258染色发现正常心肌细胞核形态完整,核膜清晰,染色均匀,未见核固缩现象。阿霉素（10μM）处理的细胞部分染色质出现固缩、染色质不均匀有边集现象,部分染色质呈典型半月样改变;有的形成颗粒,细胞核裂解,产生凋亡小体。柚皮素-7-O-葡萄糖苷（10、20、40μM）细胞结构接近正常,少数有染色质轻度边集、核固缩等形态学变化。随着剂量增大,细胞保护作用减弱。2)琼脂糖凝胶电泳分析（DNA ladder）发现柚皮素-7-O-葡萄糖苷（10、20、40μM）能减少阿霉素（10μM）诱导的心肌细胞凋亡带。3)Annexin V/PI双染后流式细胞仪分析发现柚皮素-7-O-葡萄糖苷（10、20、40μM）能保护阿霉素（10μM）诱导的心肌细胞凋亡,能降低凋亡率。4)RT-PCR检测发现柚皮素-7-O-葡萄糖苷（10、20、40μM）能减少心肌细胞Caspase-3,Caspase-9 mRNA的表达,增加Bcl-2和HO-1 mRNA及其蛋白表达;并能降低心肌细胞内钙离子浓度。3.对内源性抗氧化酶的诱导作用:柚皮素-7-O-葡萄糖苷（10、20、40μM）能增加心肌细胞GCLM、GCLC和NQO1 mRNA的表达;上调NQO1的蛋白表达;增加Nrf2的核转位和磷酸化ERK1/2表达。结论:柚皮素-7-O-葡萄糖苷对阿霉素诱导的心肌损伤有一定保护作用,能提高损伤心肌细胞内GSH水平,降低MDA含量、增强SOD、CAT和GSH-Px活力。能抑制心肌细胞内钙超载、减少Caspase-3,Caspase-9 mRNA的表达、增加凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达和诱导心肌细胞内源性抗氧化酶GCL、HO-1和NQO1的表达而对心肌细胞凋亡具有明显的抑制作用,结果初步证实柚皮素-7-O-葡萄糖苷能通过增加Nrf2核转位及ERK1/2的磷酸化诱导内源性抗氧化酶而具有抗氧化,钙通道阻断及抑制心肌细胞凋亡作用,但过高的剂量下对心肌细胞亦有损伤作用。
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