红花提取物对激素诱导骨髓间充质干细胞成脂分化的干预作用

论文摘要

目的：激素性股骨头缺血性坏死可能与激素诱导下骨髓间充质干细胞（BMSCs）的成脂分化有关,活血化瘀中药对该病早期的防治有明显疗效。通过观察中药红花活血化瘀有效成分羟基红花黄色素A （HSYA）对激素性股骨头缺血性坏死相关指标的影响,研究HSYA对激素性股骨头缺血性坏死的防治作用,由此进一步验证活血化瘀中药对激素性股骨头坏死的防治效果,探讨发病机制和中药作用机理,为临床提供更有效的治法和方药的实验依据。方法：18只健康30天龄SD大鼠,取其股骨内髓腔组织,培养出骨髓间充质干细胞,传代、纯化、鉴定,以MTT法得出HSYA对骨髓间充质干细胞生长的最佳浓度,以最佳细胞培养浓度为药物中剂量组,2倍HSYA最佳浓度计量为高剂量组,1/2最佳浓度为中剂量组。空白组为以含15%胎牛血清的DMEM培养基培养；对照组以含15%胎牛血清的DMEM培养基99ml+地塞米松储存液1ml的培养液干预；高剂量组含15%胎牛血清的DMEM培养基99ml+地塞米松储存液1ml+20mgHSYA培养液干预；中剂量组以含15%胎牛血清的DMEM培养基99ml+地塞米松储存液1ml+10mgHSYA培养液干预；低剂量组以含15%胎牛血清的DMEM培养基99ml+地塞米松储存液1ml+5mgHSYA培养液干预。上述5组培养6天后,行透射电镜、油红0染色、甘油三酯检测、PCR法检测PPARγmRNA和aP2mRNA的表达等检测。结果：①细胞鉴定：形态学方面：光镜下观察大鼠BMSCs,细胞呈现出成纤维状或纺锤状,贴壁生长,细胞相互紧密贴附生长,逐渐融合成片,沿胞体长轴有序排列,呈旋涡状。BMSC经传代纯化,三代BMSCs形态单一均匀,融合后呈典型的极性,漩涡状生长；以流式细胞仪进行标志抗原CD45和CD90阳性表达率检测方面检测结果示：生长良好的贴壁细胞在第3代时行表面标记物检测。第3代细胞CD45阳性率约2.0%,CD90阳性率达99.6%。可以说明本实验采用全骨髓贴壁法体外分离培养的细胞为BMSCs。②油红0染色示：空白组未见被染色的脂肪细胞；对照组染色的脂肪颗粒最明显。高、中、低剂量组均见数量较少的染色后的脂肪滴,均较对照组少。③电镜观察：空白组、高、中、低剂量组未发现脂肪细胞,细胞内未见脂肪颗粒,细胞形态基本正常,对照组细胞内见大量脂肪颗粒堆积。④甘油三酯检测：对照组细胞内的甘油三酯含量较空白组明显升高,而HSYA各组较对照组均有明显下降,药物三组之间无明显差异。与对照组比较,HSYA低、中、高剂量组均较对照组明显降低。⑤荧光定量PCR：各组成脂转录因子PPARγmRNA和aP2mRNA的表达,其中PPARγmRNA对照组明显高于空白组,HSYA高、中低剂量组与对照组均有非常显著性差异（P<0.01）,与空白组比较,HSYA高、中剂量组与空白组比较P>0.05,无明显差异,低剂量组与空白组比较P<0.01,有高度显著性差异。aP2mRNA对照组明显高与空白组（P<0.01）,高中低剂量组分别与对照组比较P<0.05,均有明显差异；高、中剂量组与空白组比较P<0.05,见明显差异,低剂量组与空白组比较P>0.05,遂低剂量组与空白组无明显差异。结论：1.本实验体外分离培养的细胞经形态学、流式细胞仪检测表面标志物等技术鉴定其属于BMSCs,且具有较高的纯度。2.大剂量激素诱导可促使BMSCs向成脂分化,使脂肪细胞增多。3. HSYA干预后,细胞内甘油三酯含量、PPARγmRNA和aP2 mRNA的表达较对照组都明显降低,油红0染色、电镜等见脂肪细胞及颗粒明显较单纯激素干预的后所见脂肪细胞及颗粒少,提示HSYA可抑制激素诱导下的BMSCs成脂分化。4. HSYA防治激素性股骨头缺血坏死的机理不仅是改善股骨头的微循环,同时也可抑制BMSCs成脂分化,从而促进其成骨分化。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 SD大鼠BMSCs分离、纯化、培养及鉴定
• 实验材料
• 实验方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 第二部分 HSYA对激素诱导骨髓间充质干细胞成脂分化的影响
• 实验材料
• 实验方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 综述
• 参考文献
• 作者简历