油菜抗草甘膦除草剂资源的鉴定及筛选

论文摘要

油菜（rapeseed）是世界广泛种植的油料作物之一,是重要的食用油源和蛋白质饲料来源,也是重要的工业原料。我国油菜种植面积和总产量均居世界首位,然而每年的生物和非生物胁迫都对油菜的高产稳产造成严重威胁,提高油菜抗胁迫能力将能显著提高产量。草害是油菜最重要的生物胁迫之一,也是油菜高产的主要障碍之一,不仅造成油菜大幅减产,还花费了大量的劳动力除草。因此,对杂草的有效防治与根除对油菜生产具有重大意义。影响油菜生产的杂草种类繁多,化学除草对施药时间和剂量都有严格要求,对作物有一定的适用范围,对杂草有一定的选择性,往往难以达到理想的效果。因此,培育和推广抗除草剂油菜品种可以有效控制草害,减少中耕除草用工,提高油菜产量,增加效益。本研究一方面将人工合成改造的抗草甘膦基因cp4-epsp转化拟南芥和油菜进行抗性鉴定,另一方面对油菜种子进行甲基磺酸乙酯（Ethyl methanesulfonate, EMS）诱变,在M2代中筛选抗草甘膦突变体,同时还克隆了白菜型油菜中的5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶（5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase, EPSP合成酶）基因,其主要研究结果如下：（1）获得了cp4-epsp转基因拟南芥和油菜植株,抗性鉴定结果表明转基因植株在稀释100倍的41%农达异丙胺盐制剂喷洒条件下仍能继续生长,而对照即使使用稀释400倍的同等制剂喷洒也不能存活。（2）以湘油15号种子为材料,使用0.45%的EMS诱变剂处理后获得了诱变群体M1代。用稀释200倍的41%农达异丙胺盐制剂喷施M2代4-5片真叶期植株筛选抗草甘膦突变体,结果植株10天后全部枯萎凋亡,没有筛选到抗性株。（3）在白菜型油菜Yellow Sarson中克隆到epsp基因的两个拷贝epsp384和epsp319。序列分析表明这两个拷贝的核酸序列同源性为92%,蛋白质序列同源性为95%。进化树分析显示epsp384与中国白菜中的epsp基因来源相同,epsp319与甘蓝型油菜中的epsp基因来源相同。与21个不同来源的EPSP合成酶蛋白质序列进行比对分析发现,其大部分氨基酸均高度保守。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 1 前言
• 1.1 抗除草剂作物的发展
• 1.2 草甘膦灭生机制及植物抗草甘膦机制
• 1.2.1 草甘膦灭生机制
• 1.2.2 使植物获得草甘膦抗性的途径
• 1.3 植物抗草甘膦研究进展
• 1.3.1 抗草甘膦新材料的鉴定和创造
• 1.3.2 草甘膦靶酶-EPSP合成酶结构和功能的关系
• 1.3.3 草甘膦抗性的分子基础
• 1.3.4 以草甘膦为靶标的其他抗性途径
• 1.3.5 草甘膦以及抗草甘膦作物所面临的环境问题
• 1.4 本研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 实验试剂
• 2.1.3 菌株和质粒
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 cp4-epsp基因的转化和抗性鉴定
• 2.2.1.1 cp4-epsp基因的检测引物与PCR反应程序
• 2.2.1.2 质粒抽提及农杆菌转化
• 2.2.1.3 拟南芥转化
• 2.2.1.4 转基因拟南芥阳性苗的筛选
• 2.2.1.5 转基因拟南芥抗性鉴定
• 2.2.1.6 油菜转化
• 2.1.1.7 转基因油菜抗性鉴定
• 2.2.2 油菜种子EMS诱变
• 2.2.2.1 预备实验确定合适的诱变浓度
• 0代种子的处理及种植'>2.2.2.2 M₀代种子的处理及种植
• 1代表型观察及套袋自交'>2.2.2.3 M₁代表型观察及套袋自交
• 2代种植及筛选'>2.2.2.4 M₂代种植及筛选
• 2.2.3 白菜型油菜Yellow Sarson epsp基因的克隆及分析
• 2.2.3.1 白菜型油菜Yellow Sarson epsp基因的克隆
• 2.2.3.1.1 Yellow Sarson RNA的提取
• 2.2.3.1.2 Yellow Sarson cDNA第一链的合成及actin检测
• 2.2.3.1.3 Yellow Sarson epsp cDNA的扩增
• 2.2.3.1.4 PCR产物的回收与克隆测序
• 2.2.3.2 Yellow Sarson epsp基因的分析
• 3 结果和分析
• 3.1 cp4-epsp基因的转化及抗性鉴定结果和分析
• 3.1.1 拟南芥转化和抗性鉴定
• 3.1.1.1 转基因拟南芥阳性苗的筛选
• 3.1.1.2 转基因拟南芥的抗性鉴定结果与分析
• 3.1.2 油菜转化和抗性鉴定
• 3.2 油菜种子EMS诱变结果和分析
• 3.2.1 EMS诱变浓度的确定
• 1代表型观察及套袋自交'>3.2.2 M₁代表型观察及套袋自交
• 2突变群体的除草剂筛选'>3.2.3 M₂突变群体的除草剂筛选
• 3.3 白菜型油菜Yellow Sarson epsp基因的克隆及分析
• 3.3.1 Yelllow Sarson总RNA的提取及cDNA第一链的合成
• 3.3.2 Yellow Sarson epsp基因全长cDNA的克隆
• 3.3.3 EPSP合成酶蛋白质序列分析
• 4 讨论
• 4.1 cp4-epsp基因的实际应用性
• 4.2 EMS诱变的有效性
• 4.2.1 EMS诱变浓度的选择及群体大小的确定
• 4.2.2 对诱变群体进行表型评估的不足
• 4.3 EPSP合成酶改造所面临的困难
• 参考文献
• 附录
• 致谢