赤点石斑鱼MHC基因的克隆与多态性分析

论文摘要

主要组织相容性复合体（Major histocompatibility complex,MHC）是免疫系统中对蛋白抗原异物起反应的一类重要的免疫因子,广泛分布于各种脊椎动物体内。本研究以我国具有重要经济价值和养殖前景的赤点石斑鱼（Epinephelusakaara）为实验材料,采用PCR、RT-PCR、SMART-RACE、SSCP等技术对MHC家族MHCⅠA、MHCⅡA和MHCⅡB 3个基因进行克隆与多态性分析。主要结果如下:1.本研究首次成功克隆获得赤点石斑鱼的MHC classⅠα链,MHC classⅡα链及β链等3个重要的非特异性免疫因子的cDNA全序列,其中MHC classⅠα链全长1720bp,含3’UTR、启动子、多肽结合区（α1和α2）、免疫球蛋白样区（α3）、跨膜区、胞内区和5’UTR。MHC classⅡα链全长1870bp,含3’UTR、启动子、多肽结合区（α1）、免疫球蛋白样区（α2）、跨膜区、胞内区和5’UTR。MHC classⅡβ链全长1350bp,含3’UTR、启动子、多肽结合区（β1）、免疫球蛋白样区（β2）、跨膜区、胞内区和5’UTR。2.3个免疫蛋白因子均具有经典MHC蛋白分子的空间结构,在多肽结合区均存在极其丰富的变异。其中Ⅰα链的α1（1-90位）和α2（91-203位）分别由1个α螺旋和4个反向平行的β折叠组成,形成1个深沟状凹槽,α3（204-298位）主要由β折叠组成。Ⅱa链的α1（24～99位）由1个α螺旋和4个反向平行的β折叠组成,α2（100～200位）由多个β折叠组成。Ⅱβ链的β1（20～103位）1个α螺旋与4个反向平行的β折叠构成多肽结合区,β2（116～204位）由多个β折叠构成两个反向平行的三明治结构。3.3个非特异性免疫因子在脑、心、脾、肝、头肾、肠、肌肉、血细胞、胸腺、性腺,鳃,胃等12个组织均能有效表达,在头肾,脾,胸腺等免疫组织表达量不仅高,而且表达多态性也异常丰富。递呈内源性抗原的MHC classⅠ在与外界病原接触较多的鳃,肌肉,肠等组织表达较弱,而递呈外源性抗原的MHCclassⅡ在鳃,肌肉,肠等组织则有较强表达,体现了其表达与功能的适应性。4.建立了利用SSCP技术分离多肽MHC基因片段的方法,极大提高了MHC多态性基因的检测效率。本研究所获得的SSCP特异性引物及其建立的检测方法,将可为今后大量检测赤点石斑鱼多态性MHC序列,筛选可针对特定病原的特异序列提供有力的工具。5.根据3个分子的IGC区氨基酸序列构建了脊椎动物的系统进化树,其拓扑结构基本一致,不仅证实了硬骨鱼类的单系起源,而且支持了MHC系统分化早于原始鱼类向更高等脊椎动物进化的观点,同时也表明了3个分子的IGC区氨基酸序列可以作为研究鱼类物种间进化关系的良好标记。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 绪言
• 1 鱼类MHC基因及其研究进展
• 1.1 鱼类的免疫系统
• 1.2 MHC基因简介
• 1.3 MHC基因的生物学特性
• 1.4 MHC基因家族
• 1.5 MHC基因的主要功能
• 1.6 鱼类MHC基因的分布与表达特性
• 1.7 MHC基因在鱼类研究中的应用与展望
• 2 赤点石斑鱼研究进展
• 2.1 赤点石斑鱼的形态特征
• 2.2 赤点石斑鱼的地理分布
• 2.3 当前赤点石斑鱼的相关研究
• 3 本研究的目的与意义
• 第二章 赤点石斑鱼MHC ⅠA基因的克隆和多态性分析
• 1 材料
• 1.1 样品的采集与鉴定
• 1.2 主要仪器
• 1.3 主要试剂
• 1.4 常用溶液配制
• 2 方法
• 2.1 mRNA的提取
• 2.2 RT-PCR扩增
• 2.3 PCR引物设计
• 2.4 SMART-RACE扩增
• 2.5 琼脂糖凝胶电泳
• 2.6 PCR产物的回收和纯化
• 2.7 序列测定
• 2.8 SSCP分析
• 2.9 序列拼接及cDNA全序列分析
• 3 结果
• 3.1 赤点石斑鱼各组织总RNA的提取
• 3.2 MHC ⅠA基因全长cDNA的克隆和序列分析
• 3.3 MHC ⅠA基因的氨基酸序列分析和蛋白质二级结构和空间结构预测
• 3.4 赤点石斑鱼MHC ⅠA基因的组织表达多态性分析错误!
• 4 讨论
• 4.1 赤点石斑鱼MHC ⅠA基因的序列特征分析
• 4.2 赤点石斑鱼MHC ⅠA基因的空间结构分析
• 4.3 赤点石斑鱼MHC ⅠA基因的表达多态性分析
• 4.4 MHC ⅠA基因的同源性和系统发生分析
• 第三章 赤点石斑鱼MHC ⅡA基因的克隆和多态性分析
• 1 材料
• 2 方法
• 2.1 mRNA的提取
• 2.2 RT-PCR扩增
• 2.3 PCR引物设计
• 2.4 SMART-RACE扩增
• 2.5 琼脂糖凝胶电泳
• 2.6 PCR产物的回收和纯化
• 2.7 序列测定
• 2.8 SSCP分析
• 2.9 序列拼接及cDNA全序列分析
• 3 结果
• 3.1 MHC ⅡA基因全长cDNA的克隆和序列分析
• 3.2 MHC ⅡA基因的氨基酸序列分析和蛋白质二级结构和空间结构预测
• 3.3 赤点石斑鱼MHC ⅡA基因的组织表达多态性分析错误!未定义书签。
• 4 讨论
• 4.1 赤点石斑鱼MHC ⅡA基因的序列特征分析
• 4.2 赤点石斑鱼MHC ⅡA基因的空间结构分析
• 4.3 赤点石斑鱼MHC ⅡA基因的表达多态性分析
• 4.4 MHC ⅡA基因的同源性和系统发生分析
• 第四章 赤点石斑鱼MHC ⅡB基因的克隆和多态性分析
• 1 材料
• 2 方法
• 2.1 RT-PCR扩增
• 2.2 PCR引物设计
• 2.3 SMART-RACE扩增
• 2.4 琼脂糖凝胶电泳
• 2.5 PCR产物的回收和纯化
• 2.6 序列测定
• 2.7 SSCP分析
• 2.8 序列拼接及cDNA全序列分析
• 3 结果
• 3.1 MHC ⅡB基因全长cDNA的克隆和序列分析
• 3.2 MHC ⅡB基因的氨基酸序列分析和蛋白质二级结构和空间结构预测
• 3.3 赤点石斑鱼MHC ⅡB基因的组织表达多态性分析错误!
• 4 讨论
• 4.1 赤点石斑鱼MHC ⅡB基因的序列特征分析
• 4.2 赤点石斑鱼MHC ⅡB基因的空间结构分析
• 4.3 赤点石斑鱼MHC ⅡB基因的表达多态性分析
• 4.4 MHC ⅡB基因的同源性和系统发生分析
• 结论
• 附图
• 参考文献
• 在学期间研究成果
• 致谢