论文摘要
乙肝病毒是一种小的双链DNA病毒,是已知的感染人类最小的双链DNA病毒,属于嗜肝DNA病毒科（hepadnavividae）。乙肝病毒感染肝细胞后,能引起一系列的疾病,如急性肝炎、慢性肝炎、肝硬化、肝癌等,还往往伴有严重的并发症。目前世界范围内有超过3.5亿人为乙肝慢性感染,其中一部分最终转为肝癌（hepatocelluar carcinoma,HCC）,是威胁人类健康的主要的感染性疾病之一。机体感染HBV后,能否产生有效的抗病毒细胞免疫反应清除肝细胞内的病毒决定着HBV感染后的发生、发展和转归。由于HBV的感染宿主仅限于人和猩猩,目前仅仅是通过其他肝DNA病毒和黄病毒属感染其宿主后致病机制的一个间接反映,还有是在细胞和小鼠模型上取得的生化、病毒学、免疫学等方面的进展。研究发现,造成HBV慢性感染的主要原因是不能产生有效的针对相应抗原细胞免疫反应,有效的抗病毒细胞免疫反应的产生是一个复杂的过程,包括免疫细胞与抗原呈递细胞之间的相互作用,也包括可溶性细胞因子的介入。HBV的基因组双链DNA包含一个长链和一个短链,有四个重叠的开放读码框架,分别为:S/preS, C/preC,P和X。HBX能反式激活病毒和细胞基因,包括一些转录因子、生长调控基因。大量研究表明HBV的X蛋白会激活多种病毒、细胞的转录因子的转录,被HBx激活的启动子和增强子包含NF-kappaB,AP-1,AP-2,c-EBP,ATF/CREB或钙激活因子NF-AT在DNA上的结合活性。共刺激分子是细胞表面的一组糖蛋白分子,是T细胞与所有其他宿主细胞相互作用所必须的。在T细胞通过TCR识别特异性抗原的同时,共刺激分子也聚集到免疫突触部位与其配体结合后触发下游信号传导,对TCR信号起到正向或负向的调节作用,从而影响T细胞的活化,增殖与功能。首先,我们利用基因芯片技术,分析HBV感染后肝细胞内基因表达谱变化情况。虽然迄今为止,也有很多关于HBV感染的研究,但人们对其致病机制,特别是慢性乙型肝炎的致病机制还不是很清楚。我们期待通过寻找HBV感染后肝细胞内表达发生特异性改变的共刺激分子,为进一步阐明HBV感染、特别是慢性HBV感染的致病机制提示信息。首先我们利用Operon公司的基因芯片,以整合了HBV全基因组、能分泌HBV病毒颗粒的HepG2.2.15细胞作为HBV感染的细胞模型,以HepG2细胞作为对照,分析两种细胞基因表达谱,筛选显著上调或下调的基因。HepG2.2.15细胞是人肝癌细胞株HepG2细胞转染HBV基因后的细胞,乙肝病毒基因已稳定整合,能分泌各种病毒蛋白和病毒颗粒,是研究乙肝病毒感染的常用的体外模型。所用芯片为Operon公司的35k human Genome Array,利用该芯片对HepG2.2.15和HepG2细胞的基因表达谱进行分析后,发现显著上调或下调的基因多为癌相关基因、代谢相关基因、细胞骨架和黏附分子以及凋亡相关基因。说明在肝癌的发生、发展中,抑癌基因的失活、代谢相关酶类基因活性的异常及促使细胞进入增殖周期的相关基因的活化等因素发挥了重要的作用。然而我们更关注共刺激分子,对差异表达的共刺激分子筛选后发现在CD40、CD80、CD86、B7RP-1、OX40、B7-H1、B7-DC、B7-H3和B7-H4中只有CD40显著上调。经实时定量PCR、细胞流式技术、免疫印记分别进行验证,最终确认肝细胞中因HBV感染而显著上调的共刺激分子CD40,也说明芯片的结果是可靠的。肿瘤坏死因子（TNF）和肿瘤坏死因子受体（TNFR）超家族部分成员是共刺激分子的重要组成部分。CD40是肿瘤坏死因子受体家族一成员,表达在B细胞、活化的T细胞、单核细胞、内皮细胞、树突状细胞和多种肝癌细胞系。CD40在多种细胞的广泛表达提示在免疫和宿主防御反应中发挥多种功能。并且根据细胞种类、细胞分化阶段的不同所发挥的作用也不尽相同。CD40L主要表达在活化的T细胞。CD40与其配体CD40L结合后发挥的作用主要有调节细胞生长、凋亡和免疫调节,即:促使B细胞增殖、B细胞产生的免疫球蛋白的亚类转换和抑制B细胞的凋亡;传递凋亡信号从而抑制恶性淋巴细胞系和一部分肝癌细胞系的生长;增强恶性造血细胞的抗原递呈和免疫识别、提高恶性B细胞的免疫原性而诱导肿瘤特异性的T细胞免疫。以上信息提示对CD40通路的研究可为癌症的治疗开辟一个全新的视野。然后,我们根据adr亚型HBV基因组序列设计扩增HBV基因组各基因的PCR引物,扩增HBV基因组各基因片段,与真核表达载体pcDNA3.1（+）构建重组子,经双酶切和测序鉴定后分别命名为pcDNA3.1（+）/HBs、pcDNA3.1（+）/HBc、pcDNA3.1（+）/HBe、pcDNA3.1（+）/HBp、pcDNA3.1（+）/HB-preS1、pcDNA3.1（+）/HB-preS2、pcDNA3.1（+）/HBx。转染HepG2细胞经抗生素G418筛选后获得稳定表达HBV基因组各蛋白的HepG2细胞系,分别命名为HepG2HBs、HepG2HBc、HepG2HBe、HepG2HBp、HepG2HB-preS1、HepG2HB-preS2、HepG2HBx细胞,并经细胞免疫化学染色和细胞流式技术分析鉴定各蛋白在细胞中的表达。然后细胞流式技术分析HBV基因组各蛋白对CD40表达的调节作用,最终确定HBV X蛋白上调了CD40在HepG2细胞中的表达。为进一步验证HBV X蛋白对共刺激分子CD40表达的上调作用,采用RT-PCR、定量PCR和细胞流式技术分析PLC/C4细胞系中共刺激分子CD40的表达,同样得到HBV X蛋白的表达上调共刺激分子CD40在PLC细胞的表达的结果,而X基因被干扰的C4细胞CD40未上调表达。综上所述,我们利用Operon公司的基因芯片,以整合了HBV全基因组、能分泌HBV病毒颗粒的HepG2.2.15细胞作为HBV感染的细胞模型,以HepG2细胞作为对照,分析其基因表达谱筛选显著上调或下调的基因。经定量PCR、细胞流式技术、免疫印记进行验证,最终得到显著上调的共刺激分子CD40。然后,我们根据adr亚型HBV基因组设计扩增HBV各基因的PCR引物,构建HBV各基因重组子,转染HepG2细胞获得稳定表达HBV各蛋白的HepG2细胞系。然后用细胞流式技术分析HBV基因组各蛋白对CD40表达的调节作用,确定HBV X蛋白上调了CD40在HepG2细胞中的表达,并在PLC/C4细胞系进行了进一步验证。因此得出HBV感染后通过其编码的X蛋白上调CD40在肝细胞中的表达,提示可以通过CD40通路的研究进一步阐述HBV感染的致病机制和寻找新的治疗策略。