论文摘要
将外源基因导入哺乳动物细胞并获得表达外源基因的细胞系,在生物学及基础医学研究中有着广泛的应用。动物细胞被外源基因转化通常是一种低效率的过程,在几万或几十万个细胞中仅有少数几个细胞可整和外源基因,即使对于高效率的转化方法,所产生的转化株也是少数。如何从大量的未转染的细胞中选出转化株,是基因转移技术十分关键的一环。 传统的方法中,用于哺乳动物细胞基因工程的载体通常需要外加一个遗传标记基因以便于进行选择。例如,利用载体携带的抗生素抗性基因,通过一定浓度的选择性培养基进行一段时间的加压培养,然后挑取单克隆扩大培养,经过鉴定获得所要的细胞系。但是载体中由于目的基因和抗生素抗性基因分别由不同的启动子启动,往往不能实现共同表达,所以采用传统的方法获得表达目的基因的细胞系,工作量大,所需时间也长。 免疫磁珠分选（Magnetic Cell Sorting,MACS）技术由于其快速、高效并且具有可供利用的试剂盒等特点,目前已广泛应用于细胞的分选。此项技术基于抗体对细胞表面抗原的特异识别,将偶联在抗体上的磁珠标记在细胞上,在磁场作用下达到分离细胞的目的。我们将MACS分选技术引入到转染细胞的分选中,通过构建一个带有细胞表面标记基因CD34的双顺反子载体,使转染细胞在表达目的基因的同时表达CD34标记基因,然后通过MACS分选来获得所需的表达目的基因的细胞系。 CD34是属于Ⅰ型跨膜蛋白的磷酸糖蛋白,主要表达于造血干/祖细胞（hematopoietic stern/progenitor cell,HSC/HPC）上。我们利用从CD34+细胞中提取的RNA反转录得到的cDNA为模板,PCR扩增得到CD34的一种人工截短体形式dCD34（delected variant of CD34）。将其克隆入pGEM-T-easy载体中,测序证明其包含了完整的胞外域及跨膜部分,但是缺失了胞内域。 为了实现目的基因与CD34基因的共表达,我们采用内部核糖体进入位点（internal ribosome entry site,IRES）序列构建了双顺反子表达载体。在上游启动子的控制下,IRES序列及与之相连的基因可同时转录,并以不依赖帽的方式启动远端mRNA的翻译,从而在同一转录本上翻译出不同的蛋白。我们将酶切得
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