论文摘要
程序性细胞死亡（PCD）是生物体内高度协调的生理过程，在植物发育、分化和压力诱导下都发挥着重要作用。在哺乳动物中很多抑制或诱导PCD的基因已经被克隆和分析，但是却很少在植物中发现它们的同源基因。 我们先前在水稻中克隆并报道了一个与PCD相关的基因——OsPDCDS，它的过表达能够使转基因植株出现多种PCD的特征。在这篇论文中，我们将对OsPDCD5基因的特征进行详细地分析。OsPDCD5基因的cDNA全长为416bp，编码一个128aa的蛋白质。RT-PCR分析表明OsPDCD5基因在成熟根和叶片中的表达水平分别高于幼根和幼叶，而且在水稻杆中的表达是沿顶端到根部方向逐渐递减，说明OsPDCD5的表达与叶片和根的衰老以及杆的发育有关。我们使用anti-OsPDCD5的多克隆抗体检测OsPDCD5在水稻多种组织中的分布，免疫杂交结果表明OsPDCD5在水稻叶片、叶鞘、幼穗、杆的不同节段中都有表达，但是在花药组织中不表达。另外，我们发现UV-B照射能诱导OsPDCD5的表达，无论是在转录水平和蛋白水平。最后，我们使用酵母双杂交方法筛选水稻cDNA文库，获得了OsPDCD5的相互作用蛋白——类钙调磷酸酶B相互作用蛋白激酶23（OsCIPK23），它是类钙调磷酸酶B（CLBs）和CLB相互作用蛋白激酶（CIPKs）信号网络的一员。通过GST沉降分析进一步证实OsPDCD5和OsCIPK23在体外能够相互作用。 在哺乳动物中PCD被主要分成两类：凋亡和自噬。在自噬过程中，一部分细胞质被双层膜结构包裹形成自噬体，然后靶向运输到液泡，被液泡内水解酶降解。双层膜结构的形成与两条类泛素修饰途径有关，其中一个修饰途径是Atg8与PE连接反应。Atg8的C末端首先被半胱氨酸蛋白酶Atg4切割，随后Atg8暴露出的甘氨酸被Atg7激活后转到Atg3，最终实现Atg8与PE相连。近期研究已经在拟南芥中分离了Atgs家族，但是迄今为止并没有关于水稻Atgs家族和自噬途径的研究报道。在本论文的第二章中，我们首先在水稻中分离了两个自噬相关基因，OsAtg8和OsAtg4。RT-PCR结果表明OsAtg8和OsAtg4基因在水稻成熟叶片、幼叶、成熟根、幼根、叶鞘和幼穗组织中具有一致的表达水平。为了继续研究这两个基因是否与酵母同源基因具有相似的特点，我们对酵母中表达的OsAtg8融合蛋白进免疫杂交分析，结果表明OsAtg8的C末端能够在酵母细胞中被切割。将OsAtg8的C末端117位甘氨酸突变成丙氨酸后，OsAtg8-Gly117Ala融合蛋白的C末端不能被切割，说明Gly117是OsAtg8的C末端切割反应所必须的，这些与对哺乳动物Atg8的Gly120的研究结果相一致。另外，我们通过酵母双杂交的方法证实了OsAtg8和OsAtg4之间能够发生相互作用，而且发现OsAtg8蛋白Gly117的突变并不能影响它们的作用。这些结果说明OsAtg8和OsAtg4在结构和功能上都是非常保守的，提示在水稻中存在保守的自噬途径。