全反式维甲酸促人脐血多能干细胞向多巴胺能神经元分化

论文摘要

帕金森氏病是一种中老年常见神经系统变性疾病,该病的病理生理过程主要为中脑黑质区慢性进展的多巴胺神经元变性、缺失。目前的治疗措施多为改善症状,不能够改善多巴胺神经元的变性、缺失,因而无法延缓病情的进展。具有神经分化潜能的干细胞可以通过移植替代变性、缺失的多巴胺神经元,成为帕金森氏病治疗的一种新的可以选择的途径。然而,选择移植安全、有效、没有伦理问题限制的干细胞来源,成为干细胞移植治疗帕金森氏病需要进一步探讨的问题。研究目的：通过体外实验探讨在全反式维甲酸作用下,具有多向分化潜能、低免疫原性的人脐带血多能干细胞CB-SCs （cord blood-stem cells）向多巴胺能神经元的分化。研究方法：1.采集脐带血样本：告知并签订知情同意书后,采集济南市中心医院产科健康产妇脐带血样本10例。2. CB-SCs分离、培养及实验分组：分离、培养脐带血干细胞CB-SCs达到一定数量后,分为无血清培养基对照组、神经培养基对照组、诱导组：无血清培养基对照组使用原培养基继续孵育12～14d,神经培养基对照组换用神经培养基孵育12～14d,诱导组换用含有10μmol/L全反式维甲酸的神经培养基孵育12-14d。3. Real-time PCR检测：采用Real-time PCR技术检测CB-SCs的多巴胺神经元分化的、重要调控因子Nurrl、Wnt1、Enl表达。4.免疫荧光化学检测：将诱导组、神经培养基对照组的细胞固定、制作标本后,采用免疫荧光化学法检测神经元特异性标志物神经核蛋白NeuN的表达,以及多巴胺神经元特异性酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase, TH）、多巴胺转运体（dopamine transportor, DAT）的表达。5. ELISA检测：使用含有56mmol/L钾离子的Hank’s平衡盐溶液刺激CB-SCs分化来源的细胞去极化,收集诱导组和神经培养基对照组细胞上清液,采用ELISA法检测上清液中多巴胺神经递质的含量。研究结果：1.人脐血干细胞CB-SCs表达Nurr1、Wnt1、Enl基因未经过任何基因修饰和处理,CB-SCs在mRNA水平自身表达多巴胺神经元重要调控因子Nurr1、Wnt1、Enl。2.全反式维甲酸促进CB-SCs分化呈现神经细胞形态特点经过10μmol/L全反式维甲酸的神经培养基孵育12～14天后,大部分CB-SCs分化为神经形态样细胞；神经培养基对照组仅少量CB-SCs出现神经样分化；无血清培养基对照组CB-SCs继续扩增并保持CB-SCs的形态学特点不变。3.分化的CB-SCs表达多巴胺神经元标志物通过细胞免疫荧光化学检测分析,诱导组70±7%细胞表达NeuN;48±11%的细胞表达TH；36±9%的细胞表达DAT。神经培养基对照组仅有少量细胞表达TH和DAT, NeuN阳性细胞<15%。4.分化的CB-SCs具有释放多巴胺神经递质的功能通过ELISA实验数据分析,经过钾离子刺激去极化诱导组细胞上清液中多巴胺含量大约为940±42pg/mL,较神经培养基对照组明显升高,P<0.001；神经培养基对照组仅有基础量的多巴胺递质释放,370±15pg/mL。结论：1. CB-SCs在基因水平表达多巴胺神经元分化的重要调控因子Nurr1、Wnt1、Enl,具有向多巴胺神经元分化的潜能。2.全反式维甲酸可以促进CB-SCs较为高效地分化为多巴胺神经元,而且分化的神经元具有多巴胺神经递质释放功能。研究意义：本课题研究通过体外实验初步证明了CB-SCs向多巴胺神经元的分化能力,为人脐血多能干细胞CB-SCs今后在动物模型的研究提供了一定的实验基础和理论依据,也为干细胞移植治疗帕金森氏病提供了新的细胞选择来源和诱导分化方法。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 符号说明
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 附图
• 参考文献
• 综述1
• 参考文献
• 综述2
• 参考文献
• 致谢
• 硕士研究生期间发表的文章
• 学位论文评阅及答辩情况