龙眼成花转变与成花逆转的差异蛋白质组学研究

论文摘要

本研究以龙眼正常成花和成花逆转的花芽为研究对象,运用蛋白质组学方法和技术比较龙眼正常成花和成花逆转花芽的蛋白质组变化,应用双向电泳对花芽蛋白进行分离,从2-D凝胶上均检测到分离的蛋白质点约1000个,应用PDQuest软件对凝胶图谱进行分析,获得65个表达量差异在2倍以上的差异蛋白,其中28个蛋白在龙眼成花逆转花芽中上调表达, 37个蛋白下调表达。MALDI-TOF-TOF/MS串联质谱分析和数据库检索鉴定了其中41个差异表达蛋白,鉴定率为63%。鉴定得到的蛋白中,与龙眼成花逆转关系密切的物质和能量代谢相关蛋白,转录和翻译相关的蛋白,次生代谢相关蛋白,调控相关蛋白,抗逆相关蛋白和细胞骨架蛋白的生物学功能都得到了讨论。通过对这些差异蛋白在成花过程中的功能分析,表明这些蛋白在龙眼成花逆转过程中的差异表达可能影响了花芽的正常发育,进而导致了龙眼成花逆转。应用RT-PCR和RACE方法克隆其中4个与龙眼成花逆转关系密切的差异蛋白的基因:获得了上调表达的调控因子14-3-3蛋白（登录号FJ479618）,细胞骨架α-微管蛋白（登录号FJ479617）,转醛醇酶（登录号FJ472991）和下调表达的花青素合成酶（登录号FJ479616）的完整开放阅读框,4个基因的全长cDNA都分别在大肠杆菌中表达,获得相应外源蛋白,其中14-3-3蛋白和α-微管蛋白经过Western blotting验证确认。半定量RT-PCR结果显示,ANS和TAL在转录和翻译水平上具有同样表达差异,TUB和14-3-3在转录水平上无明显差异。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩写词
• 第一章 综述
• 1 蛋白质组与蛋白质组学
• 2 植物蛋白质组学
• 2.1 植物发育蛋白质组学
• 2.1.1 植物组织器官蛋白质组学
• 2.1.2 植物亚细胞蛋白组学
• 2.2 植物生理蛋白质组学
• 3 植物成花逆转的研究
• 3.1 植物成花逆转的研究进展
• 3.2 龙眼成花逆转研究进展
• 3.2.1 龙眼的花芽分化
• 3.2.2 龙眼的成花逆转
• 3.2.2.1 影响龙眼成花逆转的因素
• 3.2.2.2 龙眼成花逆转的研究现状
• 4 本研究的目的和意义
• 第二章 龙眼成花逆转花芽差异蛋白质组分析
• 1 试验材料
• 1.1 植物材料
• 1.2 主要生化试剂
• 1.3 主要仪器设备
• 2 试验方法
• 2.1 相关溶液的配置
• 2.2 酚抽法（Phe）制备蛋白质干粉
• 2.3 样品处理
• 2.4 蛋白质含量测定
• 2.4.1 标准曲线制作
• 2.4.2 蛋白含量测定
• 2.5 双向凝胶电泳
• 2.5.1 第一向固相化pH梯度等电聚焦电泳
• 2.5.2 胶条平衡
• 2.5.3 第二向SDS-PAGE 垂直平板电泳
• 2.5.4 染色
• 2.6 凝胶扫描及分析
• 2.7 差异点的确定
• 2.8 蛋白质胶内酶解
• 2.9 差异蛋白MALDI-TOF-TOF/MS 分析及数据库检索鉴定
• 3 结果与分析
• 3.1 双向电泳基本条件的确定
• 3.1.1 蛋白质含量标准曲线
• 3.1.2 SDS-PAGE 凝胶浓度选择
• 3.1.3 第一向IEF 等电聚焦pH 范围的选择
• 3.1.4 上样量的确定
• 3.1.5 聚焦时间的确定
• 3.2 龙眼正常成花与成花逆转的花芽蛋白质2-DE 差异分析
• 3.2.1 成花逆转不同时期花芽蛋白质的2-DE 分析
• 3.2.2 正常成花与成花逆转花芽蛋白质的2-DE 分析
• 3.3 龙眼花芽差异蛋白MALDI-TOF-TOF / MS 鉴定
• 4 讨论
• 4.1 物质和能量的代谢相关蛋白
• 4.2 转录和翻译相关蛋白
• 4.3 次生代谢相关蛋白
• 4.4 调控相关蛋白
• 4.5 胁迫相关蛋白
• 4.6 细胞骨架
• 4.7 其他蛋白
• 5 结论
• 第三章 龙眼成花逆转相关基因的克隆与表达分析
• 1 试验材料
• 1.1 植物材料
• 1.2 菌株、载体、酶及各种试剂
• 1.3 主要仪器设备
• 2 试验方法
• 2.1 总RNA 提取纯化
• 2.1.1 SDS 法提取龙眼花芽总RNA
• 2.1.2 总 RNA 纯度的测定
• 2.2 目的基因保守区克隆
• 2.2.1 cDNA 合成
• 2.2.2 RT-PCR
• 2.2.3 PCR 产物的回收纯化
• 2.2.4 目的片段与T 载体的连接转化及鉴定
• 2.3 RACE
• 2.3.1 cDNA 合成
• 2.3.2 RT-PCR
• 2.3.3 PCR 产物的回收纯化
• 2.3.4 目的片段与T 载体的连接转化及鉴定
• 2.3.5 序列分析
• 2.3.6 目的基因 ORF 克隆
• 2.4 半定量 RT-PCR
• 2.4.1 RNA 定量
• 2.4.2 RT-PCR
• 2.5 目的基因原核表达
• 2.5.1 目的基因全开放阅读框的克隆
• 2.5.2 PCR 产物的回收纯化
• 2.5.3 质粒载体的提取
• 2.5.4 BL21 感受态细胞制备
• 2.5.5 表达载体构建
• 2.5.6 目的基因转化 BL21
• 2.5.7 IPTG诱导目的基因表达
• 2.5.8 表达蛋白的SDS-PAGE
• 2.6 Western blotting
• 2.6.1 相关溶液配制
• 2.6.2 目的蛋白的SDS－PAGE
• 2.6.3 目的蛋白电转移
• 2.6.4 免疫反应
• 3 结果与分析
• 3.1 目的基因全长cDNA 的克隆及序列分析
• 3.1.1 花芽总RNA 质量
• 3.1.2 α-微管蛋白（α-tublin）全长 cDNA 的克隆及序列分析
• 3.1.3 花青素合酶（anthocyanidin synthase ANS）全长 cDNA 克隆及序列分析
• 3.1.4 14-3-3 全长cDNA 克隆及序列分析
• 3.1.5 转醛醇酶（transaldolase TAL）全长 cDNA 克隆及序列分析
• 3.2 目的基因在正常成花与成花逆转花芽中的RT-PCR分析
• 3.3 目的基因在E.coli 中的表达
• 3.3.1 α-tublin 在E.coli 中的表达
• 3.3.2 ANS 在E.coli 中的表达
• 3.3.3 14-3-3 在E.coli 中的表达
• 3.3.4 TAL 在E.coli 中的表达
• 3.4 Western blotting
• 3.4.1 Western blotting 鉴定α-tublin 表达
• 3.4.2 Western blotting 鉴定14-3-3 表达
• 4 讨论
• 5 结论
• 展望
• 参考文献
• 附图1
• 附录1
• 致谢