论文摘要
具有无限自我更新能力和多向分化潜能的胚胎干细胞（embryonic stem cell,ESC）,理论上可以分化形成机体的全部组织类型细胞。ESC向肝系的定向分化,无论对于可能的肝再生应用,还是研究肝脏早期的发育分化或肝相关疾病的发病机理、新药的代谢及毒理学等都具有重要的价值。至今,尽管多项体内外研究都已证实了ESC的肝向分化,但均没有对具体机制进行阐释,分化的结果也不太令人满意,仍然存在分化率低、细胞混杂等严重问题。弄清该过程的分子调节机制,既有利于对胚胎肝脏发育机理的理解,又有助于进行更有效的定向分化。为了探索ESC分化为肝细胞的分子基础,本研究首先联合应用一些促肝生成因子体外作用于小鼠ESC诱导其发生肝向分化,再分别利用基因芯片和经典的二维电泳结合质谱技术动态分析了该过程早期的转录组和蛋白质组的变化,发现了一些可能与分化密切相关的候选分子,为下一步详细研究分子机制提供了依据。研究分为以下三个部分:第一部分小鼠胚胎干细胞的肝向分化和验证本部分基于小鼠胚胎肝脏早期发育的分子机理,分阶段加入维甲酸（retinoicancid,RA）、成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor,FGF）、肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor,HGF）、制瘤素M（oncostatin M,OSM）、地塞米松（dexamethasone,Dex）等促肝生成因子,诱导小鼠胚胎干细胞D3（ESC-D3）的肝向分化。对分化细胞形态学、基因、蛋白表达及功能的验证分析表明,分化3天时细胞表达Sox17、Foxa2等内胚层标记,分化8天时细胞开始表达白蛋白（albumin,ALB）、细胞角蛋白18（cytokeratin 18,CK18）等肝细胞标记,并呈现肝样细胞形态,经促成熟诱导后,葡萄糖6磷酸酶（glucose-6-phosphatase,G6p）等较成熟分化基因的表达逐渐增强,并形成毛细胆管等特征性超微结构,也具有了一定的糖原合成能力;另外,在此分化过程中,甲胎蛋白（alphafetoprotein,Afp）的表达呈先上升后下降的趋势,而Alb的表达呈逐级上升的趋势。这些结果证实了小鼠ESC-D3在分化8天时出现了早期的肝向分化,而且此分化过程在基因表达模式上可大致模拟体内早期的胚胎肝脏发育。该部分成功建立了小鼠ESC定向分化为肝样细胞的体外诱导体系,为进一步的分化机制研究提供了模型基础。第二部分小鼠胚胎干细胞肝向分化过程中转录组的动态变化为探索上述分化过程的分子基础,寻找可能起关键作用的生物学通路和分子,我们首先采用基因芯片技术分析了mRNA水平上的基因表达变化。根据第一部分诱导分化的阶段性特点,本部分选取了未分化的小鼠ESC-D3（以下简称为“esc”）、分化3天细胞（加FGF、HGF前,以下简称为“esc3”）和分化8天细胞（FGF、HGF处理5天后,以下简称为“esc8”）为研究对象,采用与分化相关的小鼠干细胞芯片（mouse Oligo stem cell microarray,SuperArray公司）比较分析了它们的转录组,观察在早期发生肝向分化时调节ESC生长和维持其稳定的信号通路及分子的变化。三组细胞两两比较共发现117个基因差异表达（大于或等于2倍）,其中esc3与esc相比（以下简称为“esc3/esc”）有31个,esc8与esc相比（以下简称为“esc8/esc”）有48个,esc8与esc3相比（以下简称为“esc8/esc3”）有38个,实时定量PCR检测验证了数据的可靠性。差异体现在多个方面,反映了肝向分化时复杂广泛的转录调节,进一步的生物信息学分析发现这些变化归类集中在FGF、Notch、Wnt、BMP通路及细胞外基质、细胞连接和粘附上,提示这些信号可能与胚胎早期的肝向分化密切相关;另外,分化细胞在3天和8天呈现了不同的基因表达变化模式,前3天的变化集中在BMP和FGF通路上,而3到8天的变化则集中在FGF、Notch和Wnt通路上,体现了这些信号在胚胎早期不同分化阶段的重要作用。利用STRING数据库分析与分化发育相关差异基因的相互作用也提示了FGF、BMP、Notch、Wnt通路的核心作用,它们之间的网络联系给下一步的详细机制研究提供了一定线索。第三部分小鼠胚胎干细胞肝向分化过程中蛋白质组的动态变化为了更全面地观察上述分化过程早期的分子变化,寻找可能的分化相关蛋白,我们又分析了蛋白质组的变化。同样选取上述三组细胞为研究对象,运用经典的2-DE结合MALDI-TOF-MS/MS技术比较分析它们的蛋白质组,挖取了119个显著差异点（大于或等于2倍）进行质谱分析,经数据库搜索、去冗余后共鉴定出71个差异蛋白,代表64个不同的蛋白质,其中esc3/esc有25个,esc8/esc有25个,esc8/esc3有21个,ALB等的免疫印迹检测结果与胶图、质谱均保持一致。与基因表达类似,分化细胞的蛋白表达在3天和8天也呈现不同的变化模式,前3天以蛋白表达上调为主,3到8天则以下调为主。生物信息学分析发现这些差异蛋白主要参与维持基因组稳定、转录翻译调节/蛋白加工、能量代谢和分子伴侣等生物过程,暗示它们在胚胎早期肝向分化中的重要作用。在这些差异蛋白中,约40%（26/64）在小鼠ESC中丰富表达,有些已被报道可能与ESC分化相关,如Heat shock cognate 71 kDaprotein、78 kDa glucose-regulated protein precursor、T-complex protein 1。本文选择了小鼠ESC四个不同分化方向的具体研究作比对,发现有23（36%）个蛋白与它们相同,包括Hsp27、Vimentin、Tubulin、Platelet-activating factor acetylhydrolaseIB等,其中与拟胚体（embryoid body,EB）相关研究的重叠较多,主要存在esc3/esc组,而与神经分化相关研究的重叠较少,尤其是当较成熟晚期的多巴胺分化与esc8/esc3组相比时。这些结果之间的比对可能有助于寻找ESC分化过程中共同的、细胞类型特异性的以及发育阶段特异性的调节蛋白。另外,通过与肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）蛋白质组学研究结果比对,发现约40%（25/64）的蛋白在HCC中也显示差异表达,如Annexin、Nucleophosmin、Chlorideintracellular channel protein 1、Ribosomal protein、Vimentin、Hsp27,提示它们在肝分化相关生物过程中可能发挥重要作用。进一步对差异蛋白的相互作用网络分析发现某些蛋白虽然没有被鉴定出,却与许多差异蛋白有着相互作用,成为网络中的共同节点,如14-3-3 protein beta、insulin receptor substrate 1,为我们下一步详细研究这些相互作用在分化过程中的调控提供了一定的线索。结论1.小鼠ESC-D3在FGF、HGF等促肝因子分步诱导作用下在分化8天时发生了早期的肝向分化,而且此过程在基因表达模式上可大致模拟体内早期的胚胎肝脏发育。2.此分化过程中的基因变化集中在FGF、Notch、Wnt、BMP通路及细胞外基质、细胞连接和粘附上,提示这些信号可能与胚胎早期的肝向分化密切相关。3.这些差异蛋白及它们主要参与的转录翻译调节/蛋白加工、能量代谢和分子伴侣生物过程可能在胚胎早期肝向分化中发挥重要作用。4.分化3天和8天不同的基因、蛋白表达变化趋势反映了胚胎早期复杂精细的分子调控机制,也提示动态分析的重要性。5.在胚胎发育早期可能存在着某些共同的调节机制,比对不同研究的结果可能有助于寻找共同的、发育阶段或细胞类型特异性的分化调节蛋白。6.与HCC研究结果的重叠,暗示它们在肝分化相关生物过程中的可能作用。潜在应用价值1.为下一步研究ESC分化为肝细胞的具体机制提供候选靶点,从而有助于对胚胎肝脏发育机理的理解和指导胚胎干细胞进行更有效的肝向分化应用于肝再生。2.为研究肝分化相关疾病的分子调节机制提供线索,如HCC。创新点1.以往研究多是以分化的终末细胞为分析对象,而忽略了过程中的调节信息,本研究着眼于分化的更早期分子事件,并选取不同时间点动态分析了该过程中转录组和蛋白质组的变化。
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