Nrf2/ARE通路在溴氰菊酯神经毒性中的作用和机制

论文摘要

拟除虫菊酯类化合物是根据天然除虫菊素的结构逐步衍化而发展起来的一类新型人工合成农药，拟除虫菊酯作为一种神经毒物，其神经毒性作用机制尚未完全明了。最近研究表明，新发现的Nrf2／ARE-驱动靶基因通路具有神经保护作用。本研究以“Nrf2—ARE驱动的靶基因表达——抗氧化性物质（酶）”为轴线，以溴氰菊酯（DM）引起神经组织或细胞氧化应激为出发点，利用整体动物和体外细胞实验模型，应用生物化学与分子细胞生物学技术和方法来研究溴氰菊酯对Nrf2表达和核转位以及Nrf2驱动靶基因表达的影响和可能的机制与意义。主要研究结果如下：第一部分溴氰菊酯对神经组织和细胞的氧化应激作用和机制第1节溴氰菊酯对神经组织和细胞的脂质过氧化作用及对抗氧化系统的影响目的观察溴氰菊酯（DM）诱导大鼠大脑组织和PC12细胞的脂质过氧化作用以及对抗氧化系统的影响，为证实氧化应激参与DM中毒的机制提供依据。方法以DM 3.13、12.50mg DM／kg体重分别设为低、高剂量组，染毒大鼠1d和5d，测定大鼠大脑皮层和海马组织匀浆上清中丙二醛（MDA）、总超氧化物歧化酶（T-SOD，包括Mn-SOD和CuZn-SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽S-转移酶（GST）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）和谷胱甘肽还原酶（GR）活性；大脑组织细胞胞质碎片γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）活性和GSH含量用OPA柱前衍生反相高效液相色谱荧光法检测；用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）方法测定CuZn-SOD和GR基因的mRNA表达的相对量；不同浓度DM（终浓度0、1、10和100μmol／L，n=5）分别处理PC12细胞24h后用硫代巴比妥酸法测定细胞中MDA含量。结果（1） DM染毒5d的高剂量组大鼠大脑皮层中的MDA含量高于低剂量组，DM高剂量组海马组织中的MDA含量高于对照组和低剂量组（P＜0.01）；与溶剂对照组比较，100μmol／L DM染毒的PC12细胞MDA含量增高，是对照组的1.41倍，差异有统计学意义（P＜0.05）。（2）DM染毒5d，高、低剂量组大鼠大脑皮层中的T-SOD和CuZn-SOD活性低于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（3）DM染毒5d高剂量组大鼠大脑皮层中GSH含量为（15.13±4.49）nmol／mg pro，高于对照组（7.61±3.27）nmol／mg pro；海马组织中GSH含量为（5.38±1.78）nmol／mg pro，均低于对照组和低剂量组[（10.29±3.65）、（10.32±2.70）nmol／mg pro]；低剂量组大鼠海马GR活性（11.80±5.15）U／mg pro均低于对照组和高剂量DM组[（18.98±3.68）、（17.35±2.47）U／mg蛋白]；高剂量组海马的γ-GCS活性为（1.75±0.60）nmol.mg pro-1.min-1均低于对照组和低剂量组[（3.17±0.79）、（2.72±0.75）nmol.mg pro-1.min-1]，高、低剂量组海马的GR活性为（21.63±4.92）、（21.46±8.89）U／mg pro，均低于对照组（31.22±6.97U／mg pro），差异均有统计学意义（P＜0.05）。（4）DM染毒大鼠大脑皮层和海马组织中的CuZn-SOD和GR基因mRNA水平均未见明显改变。结论氧化应激是DM神经毒性的机制之一；表现为DM升高MDA含量，对SOD活性、GSH含量以及γ-GCS和GR活性产生影响；γ-GCS和GR活性下降可能是DM导致海马组织GSH含量降低的主要机制；而影响GR及CuZn-SOD酶活性的机制可能是转录后机制。第2节溴氰菊酯对神经组织和细胞活性氧生成的影响和机制初探目的研究溴氰菊酯对大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤（PC12）细胞和大鼠脑组织活性氧（ROS）生成的影响，以及氧化还原调节剂和抗氧化剂在溴氰菊酯对PC12细胞活性氧（ROS）生成影响中的作用。方法（1）终浓度为0、10和100μmol／L的DM分别处理PC12细胞1、6和12h后（两因素析因设计），用2′，7′-氯荧光黄双乙酸酯（DCFH-DA）荧光分光光度方法测定细胞活性氧（ROS）含量的变化；（2）终浓度为0、10和100μmol／L的DM分别处理PC12细胞1、6、24h或24、48h后，分别用荧光倒置相差显微镜或DCFH-DA荧光分光光度方法测定细胞ROS；（3）PC12细胞分别在终浓度为10mmol／L乙酰半胱氨酸（NAC）预处理2h或终浓度为500μmol／L的DL-甲硫氨酸磺酰亚胺（BSO）或终浓度为40μmol／L的叔丁基对苯二酚（tBHQ）预处理16h，再给予10μmol／L DM作用6h后，用DCFH-DA荧光分光光度方法测定细胞活性氧（ROS）含量的变化；（4）在有无预先喂饲大鼠添加tBHQ的饲料3d情况下，用12.50mg／KgDM染毒大鼠5d，用液氮快速冷冻组织电子自旋共振（ESR）直接法测定海马组织中的自由基。结果（1）析因设计试验统计结果表明，DM浓度（①）和作用时间（②）均具有统计学意义（P＜0.05），①DM作用1h，100μmol／L DM处理组细胞内ROS与其它剂量组比较具有统计学意义（P＜0.05），其DCF荧光强度值是对照组的1.79倍；DM作用6h，100、10μmol／LDM处理组胞内ROS与对照组比较均具有统计学意义（P＜0.05），其DCF荧光强度值分别是对照组的1.56倍、1.54倍；DM作用12h，各组之间比较均具有统计学意义（P＜0.05），具有剂量效应关系，100、10μmol／L DM处理组细胞内DCF荧光强度值分别是对照组的2.74倍、2.09倍。②对溶剂对照组而言，作用12h组细胞内ROS与作用6h组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05），其DCF荧光强度值是6h组的0.72倍；对10μmol／L DM处理组而言，作用12h和6h的PC12细胞内ROS与1h组比较均具有统计学意义（P＜0.05），其DCF荧光强度值分别是1h组的1.35倍，1.37倍。（2）0、10、100μmol／L DM分别作用1、6、24h，荧光倒置显微镜观察ROS变化呈剂量-时间依赖性效应关系。DM作用24h，100μmol／L DM组细胞内ROS与对照组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05），其DCF荧光强度值是对照组的1.27倍；DM作用48h，10μmol／LDM处理组细胞内ROS与对照组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05），其DCF荧光强度值是对照组的1.72倍。（3）①NAC的作用：与溶剂对照组比较，10μmol／L DM处理组PC12细胞内ROS升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）（2′，7′-二氯荧光黄（DCF）荧光强度是溶剂对照组的2.24倍），NAC处理组细胞内ROS降低，具有统计学意义（P＜0.05）（荧光强度是溶剂对照组的0.36），NAC预处理再用DM处理组细胞内ROS与DM或溶剂对照组比较均降低，差异均有统计学意义（P＜0.05），荧光强度分别是它们的0.22、0.49；②BSO的作用：与溶剂对照组比较BSO处理组细胞内ROS升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）（荧光强度是溶剂对照组的2.01倍），BSO预处理再用DM处理组细胞内ROS与DM或BSO组比较均降低，均有统计学意义（P＜0.05），荧光强度分别是它们的0.62，0.69；③tBHQ的作用：与溶剂对照组比较，tBHQ处理组细胞内ROS降低（荧光强度是溶剂对照组的0.68），差异具有统计学意义（P＜0.05）；与DM或溶剂对照组比较，tBHQ预处理再用DM处理组的细胞ROS明显降低，差异均有统计学意义（P＜0.05），荧光强度分别是它们的0.38，0.17。（4）应用ESR检测DM染毒大鼠海马组织中的自由基，自由基种类是超氧自由基或氮氧自由基或半醌自由基，DM可诱导大鼠海马自由基产生（是对照组的2.45倍），tBHQ+DM组海马自由基水平是对照组的2.97倍。结论DM能诱导机体组织和细胞ROS生成增高，可能是DM产生氧化应激的原因之一；NAC、BSO和tBHQ处理能削弱DM诱导细胞增高的ROS，巯基水平在DM增高ROS生成中有重要作用。第二部分溴氰菊酯对神经组织和神经细胞Nrf2／ARE通路的影响和机制目的研究溴氰菊酯（DM）对大鼠脑组织、原代胶质细胞或PC12细胞γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（GCS）、血红素氧合酶（HO-1）及转录因子NF-E2相关因子2（Nrf2）基因mRNA和蛋白表达的影响，以及初步研究DM对Nrf2／ARE通路的影响机制。方法（1）橄榄油溶剂对照组、低剂量和高剂量DM染毒组大鼠分别给予橄榄油、3.13mg DM／kg和12.50mg DM／kg腹腔注射，每天1次，连续染毒5d；另外，DM染毒组（12.50mg DM／kg）和溶剂对照组大鼠仅染毒1次，分别于大鼠染毒后不同时间点处死大鼠。分别用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）方法、免疫组织化学方法或Western blot方法测定脑组织中Nrf2或GCS基因mRNA和蛋白表达水平。（2）培养的原代胶质细胞分别给予10μmol／L DM或／和40μmol／L tBHQ处理1h或6h，利用免疫荧光细胞化学和激光共聚焦扫描电镜技术测定Nrf2细胞中的分布及Nrf2或GCS-HS蛋白水平。（3）PC12细胞在终浓度为10、100μmol／L DM作用1h或17h后收获细胞；PC12细胞分别在终浓度为10mmol／L乙酰半胱氨酸（NAC）预处理2h或终浓度为500μmol／L的DL-甲硫氨酸磺酰亚胺（BSO）或终浓度为40μmol／L的叔丁基对苯二酚（tBHQ）预处理16h，再给予10μmol／L DM作用1h后收获细胞；分别用RT-PCR方法、免疫荧光细胞化学合用激光共聚焦扫描电镜技术或Western blot方法测定脑组织中Nrf2基因和其驱动的靶基因GCS基因或HO-1基因mRNA和蛋白表达水平。（4）同（3）预处理细胞后，用10μmol／L DM再作用6h或12h，用OPA柱前衍生反相HPLC测定细胞GCS活性和细胞内GSH含量。结果（1）溴氰菊酯染毒大鼠的脑组织中GCS亚单位和Nrf2表达影响的剂量效应DM染毒大鼠大脑皮层和海马组织中的GCSh和Nrf2基因mRNA水平均未见明显改变；然而，高剂量DM组大脑皮层、低剂量DM组大脑皮层和海马组织中的GCS1基因mRNA水平低于对照组中各相应组织的水平，分别降低至对照组mRNA水平的71.1％、63.6％和75.2％，差异均有统计学意义（P＜0.001）；DM染毒的大鼠海马CA1、CA2、CA3、齿状回和大脑皮层均表达GCS-HS和Nrf2蛋白（免疫组织化学法），DM染毒可激活大鼠大脑皮层和海马组织中的Nrf2，诱导Nrf2和GCS-HS蛋白的表达（Western blot法）。（2）溴氰菊酯染毒大鼠的脑组织中GCS亚单位和Nrf2表达的时间进程①DM染毒后第5h和第48h大鼠大脑皮层中GCSh mRNA相对水平分别降低至对照组的83.9％、86.0％（P＜0.05），第5h、24h和48h Nrf2 mRNA分别增高至0h对照组的146.4％、145.2％和147.9％（P＜0.05）。②DM染毒后第5h和24h海马中GCSh mRNA相对水平分别增高至0h对照组的118.4％、118.4％（P＜0.05），第5h海马中GCS1 mRNA比0h对照组、24b和48b组均高，增高至对照组的121.4％（P＜0.05）。DM染毒后各时间点海马Nrf2 mRNA水平未见明显的变化（P＞0.05）。③DM染毒后海马不同分区（CA1、CA2、CA3和齿状回）和大脑皮层中的GCS催化亚单位（GCS-HS）和转录因子Nrf2蛋白水平均未见明显改变（免疫组织化学法）。（3）溴氰菊酯对原代胶质细胞Nrf2和GCS-HS蛋白表达的影响及干预实验（免疫细胞化学和激光扫描共聚焦技术）与对照组比较，tBHQ处理1h和6h导致星形胶质细胞的Nrf2总蛋白明显增高，分别增高至对照组的1.28和1.20倍（P＜0.001和P＜0.05），虽然细胞质和细胞核中的Nrf2蛋白水平未见变化，但tBHQ处理1h的星形胶质细胞中胞质和胞核中的Nrf2蛋白水平比值明显下降，降至对照组的50％（P＜0.001）。DM处理1h的星形胶质细胞中胞质和胞核中的Nrf2蛋白水平比值也明显下降，降至对照组的65％（P＜0.05）。但tBHQ或DM处理6h的未见该比值改变。同时给予tBHQ和DM处理1h的细胞的Nrf2总蛋白水平比tBHQ处理的细胞低，降至其81.1％（P＜0.05）。DM或／和tBHQ处理1h和6h的星形胶质细胞GCS-HS的表达均未见明显改变。（4）DM处理对PC12细胞Nrf2、GCS亚单位和HO-1基因表达的影响及机制（RT-PCR、免疫细胞化学、激光扫描共聚焦技术和Western blot）①DM染毒诱导转录因子Nrf2 mRNA表达、激活Nrf2，Nrf2可能参与DM对Nrf2下游基因GCSh、GCS1以及HO-1表达的调控；Nrf2／ARE通路的诱导剂tBHQ处理能诱导PC12细胞Nrf2 mRNA和蛋白的表达，激活Nrf2以及诱导Nrf2下游基因GCSh和HO-1的表达（mRNA和蛋白）。②tBHQ处理后再给予DM处理减弱tBHQ诱导Nrf2表达和激活Nrf2，且并不能维持tBHQ对Nrf2的激活，抑制tBHQ对细胞GCS-HS蛋白表达的诱导。③NAC处理降低Nrf2蛋白的表达，未能引起细胞核Nrf2蛋白变化，且NAC预处理废除DM对细胞Nrf2的诱导和激活，也抑制Nrf2下游基因HO-1mRNA和蛋白以及GCSh基因mRNA的表达，但未影响Nrf2 mRNA的表达。④BSO处理本身并不能诱导Nrf2细胞核转位和Nrf2蛋白的表达，可诱导细胞HO-1蛋白和GCSh mRNA的表达；BSO预处理潜在地抑制DM对细胞Nrf2 mRNA和蛋白的诱导以及激活，抑制DM增高HO-1和GCSh mRNA。⑤作为本研究对照受试物的6-OHDA能诱导PC12细胞Nrf2 mRNA和蛋白的表达以及激活Nrf2；6-OHDA也诱导细胞HO-1或GCSh mRNA和蛋白的表达。（5）DM、BSO、NAC或tBHQ对PC12细胞GSH含量和γ-GCS活性的影响当较大剂量（100μmol／L）的DM处理细胞较长时间（12h）时抑制γ-GCS酶活性，但GSH含量仍未见明显的变化。500μmol／L BSO预处理16h或NAC预处理2h均抑制GCS酶活性，BSO降低细胞内GSH含量，而NAC增高细胞内GSH含量。tBHQ预处理16h虽然尚未影响GCS酶活性，但增高细胞内GSH含量。结论DM多次染毒抑制大鼠海马和脑皮层中GCS1基因mRNA表达，激活转录因子Nrf2活性和诱导GCS-HS蛋白的表达；DM单次染毒后，大鼠海马GCSh和GCS1 mRNA基因表达出现上调，而脑皮层GCSh基因mRNA表达出现下调，Nrf2基因mRNA表达出现上调。体外DM能诱导细胞Nrf2表达并激活Nrf2活性，驱动Nrf2的下游基因（HO-1、GCS）mRNA和蛋白的表达，总之，体外DM可诱导Nrf2／ARE通路。DM激活Nrf2的机制除了部分增高转录水平诱导Nrf2之外，DM激活Nrf2的作用机制是活性氧依赖性和非GSH耗竭依赖性的。DM对HO-1或GCS-HS基因表达的影响机制较复杂，DM对不同的基因表达影响的机制不同；Nrf2可能在DM对这些基因表达的调控中起作用，其它多种氧化还原敏感的转录因子也可能参与。大剂量DM处理PC12细胞12h轻微地抑制GCS酶活性。提示Nrf2可能是防治DM中毒的新靶点，将为农药中毒防治研究提供新思路。第三部分Nrf2／ARE通路在溴氰菊酯神经毒性中的意义初探目的观察Nrf2／ARE通路诱导剂tBHQ预处理对DM增高PC12细胞[Ca2+]i（作为DM的细胞毒性指标）的影响，探讨Nrf2／ARE通路在DM诱导的神经毒性中的作用和意义。方法在有无40μmol／L tBHQ预处理PC12细胞16h情况下，再用100μmol／L DM处理PC12细胞6h。处理结束后，用Fura-2双波长荧光法测定细胞内游离钙。结果与对照组比较，DM处理组[Ca2+]i明显升高，tBHQ组和tBHQ+DM组[Ca2+]i增高，差异均有统计学意义（P＜0.05）；与DM组比较，tBHQ组和tBHQ+DM组[Ca2+]i降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。结果表明DM能增高[Ca2+]i，tBHQ预处理能降低DM增高的[Ca2+]i。结论Nrf2／ARE通路的诱导剂tBHQ预处理能降低DM增高的[Ca2+]i，减弱DM对PC12细胞的毒性，提示tBHQ通过改变DM诱导的[Ca2+]i紊乱部分地提供保护，Nrf2／ARE通路在DM神经毒性中发挥保护作用。总之，本课题“Nrf2／ARE通路在DM神经毒性中的作用和机制”的研究初步得出的结论是：DM暴露可诱导机体ROS生成、降低抗氧化系统，造成促氧化系统和抗氧化系统平衡失调而激活Nrf2、诱导其靶基因HO-1和GCS的表达；Nrf2／ARE通路诱导剂tBHQ能削弱DM的毒性作用（钙离子增高），这些首次的发现意味着神经系统或神经细胞中Nrf2／ARE通路参与农药中毒的机制，可诱导该通路发挥其对机体和细胞的神经保护作用。初步形成的学说见图1。Fig.1 The proposed theory concerning the effect of deltamethrin on the Nrf2/ARE pathway in neurotoxicity induced by deltamethrin （DM）.

论文目录

• 缩写词
• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 1 国内外研究现状和立题依据
• 2 研究内容和技术路线
• 3 参考文献
• 第一部分 溴氰菊酯对神经组织和细胞的氧化应激作用和机制
• 第1节 溴氰菊酯对神经组织和细胞的脂质过氧化作用及对抗氧化系统的影响
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 参考文献
• 第2节 溴氰菊酯对神经组织和细胞活性氧生成的影响和机制初探
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 参考文献
• 第二部分 溴氰菊酯对神经组织和神经细胞Nrf2/ARE通路的影响和机制
• 第1节 溴氰菊酯染毒对整体动物Nrf2、GCS亚单位mRNA和蛋白表达的影响
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 第2节 溴氰菊酯对原代胶质细胞Nrf2和GCS-HS蛋白表达的影响及干预实验
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 第3节 溴氰菊酯对PC12细胞Nrf2、GCS和HO-1基因表达的作用和机制初探
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 第4节 讨论
• 第三部分 Nrf2/ARE通路在溴氰菊酯神经毒性中的意义初探
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 参考文献
• 总结
• 致谢
• 综述 Keap1-Nrf2/ARE通路在分子毒理学中的研究进展
• 附录Ⅰ（攻读学位期间发表论文目录）
• 附录Ⅱ（附图）