小分子化合物在诱导山羊iPS细胞中的作用

小分子化合物在诱导山羊iPS细胞中的作用

论文摘要

动物胚胎干细胞(ES)为研究早期胚胎发育、基因打靶、动物克隆和再生医学提供了种子细胞。但是,由于取材困难,培养条件不稳定等因素,大动物ES细胞的研究还面临很多困难。目前,人们发现通过导入外源多能性转录因子,可使体细胞重编程为多能状态,产生的细胞被称为诱导多能性干细胞(induced pluripotent stem cells,iPS)。iPS细胞的出现可避开ES细胞的困难,从而产生一种可代替ES细胞的多能干细胞。iPS细胞系已经相继在小鼠、人、恒河猴、大鼠、猪、兔、绵羊、山羊等动物中建立。本研究主要探讨小分子化合物对产生iPS细胞的影响。1、小分子化合物对p-giPS细胞的重编程影响本实验中,通过使用携带有小鼠多能性四因子Oct4,Sox2,Klf4和c-Myc的逆转录病毒载体,转染山羊胎儿成纤维细胞(goat embryonic fibroblasts,GEF),在体外诱导培养后,得到山羊诱导多能性干细胞(goat induced pluripotent stem cells,giPS cells)。这些细胞具有扁平的人ES细胞样的形态,边缘整齐,细胞的核质比较大,AP检测阳性;能在体外长期培养,稳定传代,并且保持克隆形态不变;此外这些细胞还表达内源性多能因子Nanog,Sox2和TERT等基因,也表达阶段特异性表面抗原SSEA-4,不表达SSEA-1,TRA-1-60和TRA-1-81。但是这些细胞持续表达外源因子,不表达关键的多能因子Oct4基因,也不能在裸鼠体内形成畸胎瘤,因此我们认为这些细胞是部分重编程的多能细胞(partial goat induced pluripotent stem cells,p-giPS cells)。在诱导细胞重编程过程中,由于内源多能性因子的激活是随机性的,因此重编程的效率比较低,会产生大量的不完全重编程的细胞。而添加小分子化合物可促进细胞重编程的效率,使部分重编程细胞转变为完全重编程细胞。我们在山羊部分重编程细胞的培养液中添加小分子维生素C(Vc)和5-Aza-2′-Deoxycytidine (5-AzadC),结果发现添加小分子的实验组与对照组比较,其内源多能性因子Nanog,Sox2和TERT的表达量分别提高了4倍,6倍和10倍。但是,内源Oct4因子的表达未见上调,而且外源四因子的表达也未沉默。这一结果说明Vc和5-AzadC两种小分子能在一定程度上提高内源多能因子的表达水平,但未使之彻底转变为完全重编程细胞。2、p-giPS细胞向心肌样细胞的诱导分化本实验得到的p-giPS细胞具有多分化潜能,可在体外分化成为心肌样细胞,这些细胞表达心肌标记基因Nkx2.5,Gata-4,α-MHC和TNNi3。添加Vc和5-AzadC组的细胞与对照组相比,也具有分化为心肌样细胞的能力,但Nkx2.5,Gata-4和TNNi3的表达量在三种处理中有所不同,免疫荧光也显示三种处理下的细胞都表达Nkx2.5。上述结果说明,通过四因子诱导产生的山羊部分重编程细胞表达一些多能标记基因,但不是完全具有多能性,添加小分子Vc和5-AzadC后能提高多能性基因的表达水平,同时还具有分化为心肌样细胞的能力,这可为进一步研究山羊iPS细胞的发生过程提供帮助,从而有助于建立山羊ES细胞系和产生基因修饰的山羊。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 文献综述
  • 第一章 细胞重编程的研究
  • 1.1 核移植
  • 1.2 细胞融合
  • 1.3 诱导多能性干细胞
  • 1.3.1 重编程机制的研究
  • 1.3.2 诱导方法的改进
  • 1.3.3 动物模型
  • 1.3.4 完全多能性
  • 1.3.5 未来的研究方向
  • 1.3.6 结论
  • 第二章 小分子化合物对诱导重编程的影响
  • 2.1 microRNA 在重编程过程中的潜在作用
  • 2.2 小分子化合物参与重编程
  • 2.2.1 天然化合物维生素C(vitamin C,Vc)
  • 2.2.2 DNA 甲基转移酶抑制剂AZA 和5-AzadC
  • 2.2.3 组蛋白去乙酰化酶抑制剂 VPA,TSA 和SAHA
  • 2.2.4 MEK 和GSK3 信号通路抑制剂
  • 2.2.5 TGF-β通路抑制剂
  • 2.2.6 未来研究方向
  • 第三章 干细胞向心肌细胞分化的研究
  • 3.1 类胚体的形成和心肌细胞自发分化
  • 3.2 用特定的因子诱导心肌分化
  • 3.3 多能干细胞来源的心肌细胞的特征
  • 3.4 结论与未来的展望
  • 试验研究
  • 第四章 小分子化合物对p-giPS 细胞的重编程影响
  • 4.1 材料
  • 4.1.1 关中奶山羊胎儿
  • 4.1.2 细胞与质粒
  • 4.1.3 实验所用试剂
  • 4.1.4 仪器与设备
  • 4.1.5 溶液的配制
  • 4.2 方法
  • 4.2.1 山羊胎儿成纤维细胞的分离培养
  • 4.2.2 小鼠胎儿成纤维细胞(MEF)的分离培养和饲养层细胞的制备
  • 4.2.3 逆转录病毒的包装和感染
  • 4.2.4 碱性磷酸酶(AP)染色
  • 4.2.5 细胞RNA 的提取
  • 4.2.6 PCR 反应
  • 4.2.7 qPCR
  • 4.2.8 细胞的免疫荧光检测
  • 4.2.9 软琼脂实验
  • 4.3 结果
  • 4.3.1 山羊诱导多能干细胞(giPS cells)的获得
  • 4.3.2 碱性磷酸酶(AP)染色
  • 4.3.3 RT-PCR 检测获得的giPS 细胞内外源因子的表达
  • 4.3.4 RT-PCR 和qPCR 检测小分子处理后p-giPS 细胞的内外源因子的表达
  • 4.3.5 AP 染色检测添加小分子后的p-giPS 细胞
  • 4.3.6 细胞免疫荧光检测
  • 4.3.7 软琼脂实验检测p-giPS 细胞体外增殖能力
  • 4.4 讨论
  • 4.5 小结
  • 第五章 p-giPS 细胞向心肌样细胞的诱导分化
  • 5.1 材料
  • 5.1.1 实验所用试剂
  • 5.1.2 仪器与设备
  • 5.1.3 溶液的配制
  • 5.2 方法
  • 5.2.1 p-giPS 细胞类胚体的形成
  • 5.2.2 p-giPS 细胞分化的心肌样细胞的RNA 提取
  • 5.2.3 PCR 反应
  • 5.2.4 qPCR
  • 5.2.5 细胞的免疫荧光检测
  • 5.3 结果
  • 5.3.1 p-giPS 细胞分化的心肌样细胞表达多种心肌标记基因
  • 5.3.2 q-PCR 分析心肌样细胞的标记基因的表达
  • 5.3.3 p-giPS 细胞分化为心肌样细胞的免疫荧光
  • 5.4 讨论
  • 5.5 小结
  • 结论
  • 论文创新点
  • 参考文献
  • 致谢
  • 作者简介
  • 相关论文文献

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