利用低次烟叶蛋白制备生物活性肽及烟用香精的研究

论文摘要

本文利用碱溶酸沉法从低次烟叶中提取出可溶性蛋白质,研究了低次烟叶蛋白酶解物抗氧化和抑菌活性的变化规律,并通过超滤膜分离,确定了活性最强的肽段,同时以低次烟叶蛋白酶解物为原料,通过Maillard反应制备高质量的烟用香精。研究得到如下结论:烟叶蛋白提取过程中磨浆工艺的最佳水平组合为固液比1:17,提取液温度60℃,提取液pH8.0,磨浆两次;碱溶最佳工艺:温度60℃,pH8.0,时间60min,搅拌条件下提取三次;酸沉过程中,pH3.0,4℃静置8hr效果最佳。蛋白酸沉提取率最高为86.71%,产品中蛋白质含量为70.66%。B1K级烟叶蛋白中必需氨基酸含量最高（41.80%）。低次烟叶蛋白利用不同蛋白酶（Papain、ProtamexTM和Alcalase2.4L）进行酶解,以水解度和肽提取率为指标,以Papain酶解效果最好,通过单因素和正交试验表明:Papain酶解低次烟叶蛋白最优条件:酶用量1.25%、pH6.5、60℃、底物浓度8.00%、搅拌下酶解6hr,肽提取率相对最高为37.42%。游离氨基酸含量随酶解时间的延长而增加,酶解24hr后水解产物中游离氨基酸总量为未酶解样品中的15倍左右。建立了木瓜蛋白酶酶解低次烟叶蛋白的动力学模型:酶失活动力学常数k d=0.0077 min-1;对酶解动力学模型验证表明,该酶解动力学模型在0-300min范围内与实际结果基本相吻合。酶解液体外抗氧化活性以5kDa组分最高。Papain酶解液对超氧阴离子自由基的抑制率最高（28.41%）,接近VE（28.56%）,ProtamexTM酶解液的抑制率次之（25.48%）,Alcalase2.4L酶解液抑制率最低（24.55%）。清除DPPH自由基的能力以Papain酶解液最高为83.82%,ProtamexTM酶解液的清除率次之为80.08%,Alcalase2.4L酶解液清除率最低为71.93%,但均比VE差（93.24%）。三种酶解液清除羟自由基清除的能力依次为:Alcalase2.4L酶解液（67.18%）>ProtamexTM酶解液（65.42%）>Papain酶解液（64.17%）。酶解液抗氧化活性组分分子量集中在3-5kDa。酶解液（酶解6hr）中,色氨酸、组氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸含量,在经Papain酶解后的原液和经5kDa超滤膜处理的透过液中均最高,分别为45.87mg/mL酶解液和81.44mg/mL酶解液,而经Alcalase2.4L酶解后,四种氨基酸的总含量均最低,分别为42.89mg/mL酶解液和79.18mg/mL酶解液。酶解液和经5kDa超滤膜处理的透过液的氨基酸组成有明显差异。低次烟叶蛋白经Papain酶解后的酶解液具有抑菌活性,且只抑制大肠杆菌的生长,酶解6hr的酶解液抑菌效果最好,其中以5kDa酶解液抑制效果最佳,对大肠杆菌的最低抑菌浓度为0.40g/L,高于尼泊金丙酯对大肠杆菌的最低抑菌浓度（0.35g/L）。pH值对5kDa酶解液抑制大肠杆菌活性的影响不明显,pH3.0-10.0时,5kDa的酶解液能高效抑制大肠杆菌的生长繁殖;高温处理对5kDa酶解液的抑菌能力影响不明显,5kDa酶解液具有良好的耐热性。液质联用分析结果表明:膜超滤方法能高效实现对低次烟叶蛋白酶解液的初级分离。复合酶解技术深度酶解低次烟叶,氨基酸转化率最高达36.94%,明显优于单酶酶解效果。利用低次烟叶深度酶解液,通过Maillard反应制得的烟用香精,给烟草制品增香调味效果明显,评吸评分最高为96分。通过气质联用色谱分析表明:Maillard反应产物的醚溶性成分中酸、醇、酯成分含量较高,特别是具有明显烤烟香味和甜味的成分含量比较高。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 绪论
• 1.1 蛋白质概述
• 1.2 我国蛋白质资源基本利用状况
• 1.3 我国低次烟叶蛋白资源
• 1.4 蛋白质资源利用途径
• 1.4.1 生物活性肽
• 1.4.2 Maillard 反应
• 1.5 烟叶蛋白质开发应用前景
• 1.5.1 作为食物蛋白的来源之一
• 1.5.2 用于生产功能性肽
• 1.5.3 用于医药科学研究
• 1.5.4 在植物保护方面的应用
• 1.6 本研究课题的立项背景、研究意义和主要研究内容
• 1.6.1 本研究课题的立项背景与研究意义
• 1.6.2 主要研究内容
• 参考文献
• 第二章 低次烟叶蛋白提取工艺优化研究
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 材料
• 2.2.2 试剂与设备
• 2.2.3 方法
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 不同级别烟叶的蛋白质含量
• 2.3.2 不同级别烟叶蛋白质的氨基酸组成分析
• 2.3.3 低次烟叶蛋白质提取工艺优化
• 2.3.4 产品蛋白质氨基酸分析
• 2.4 本章小结
• 参考文献
• 第三章 低次烟叶蛋白可控酶解工艺优化研究
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 主要材料
• 3.2.2 主要试剂和仪器
• 3.2.3 试验分析方法
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 蛋白酶制剂活力测定
• 3.3.2 酶用量对酶解效果的影响
• 3.3.3 pH 值对酶解效果的影响
• 3.3.4 温度对酶解效果的影响
• 3.3.5 底物浓度对酶解效果的影响
• 3.3.6 酶解时间对酶解效果的影响
• 3.3.7 三种蛋白酶酶促水解烟叶蛋白的正交试验设计研究
• 3.3.8 搅拌方式对酶解效果的影响
• 3.3.9 酶解过程中氨基酸变化规律研究
• 3.4 本章小结
• 参考文献
• 第四章 低次烟叶蛋白可控酶解动力学模型研究
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 主要材料
• 4.2.2 主要试剂和仪器
• 4.2.3 水解度测定方法
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 动力学模型的推导
• 4.3.2 动力学模型的参数确定
• 4.3.3 蛋白酶失活的常数确定
• 4.3.4 限制性酶解的动力学模型验证
• 4.4 本章小结
• 参考文献
• 第五章 低次烟叶蛋白生物活性肽生物活性与其分子量分布、氨基酸组成关系的研究
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 主要材料
• 5.2.2 主要试剂和仪器
• 5.2.3 试验方法
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 酶解时间与肽提取率、DH 之间的关系研究
• 5.3.2 酶解液体外抗氧化试验研究
• 5.3.3 低次烟叶蛋白酶解液分子组成分布的色谱分析
• 5.3.4 低次烟叶蛋白酶解液氨基酸组成分析
• 5.3.5 低次烟叶蛋白酶解液抑菌活性研究
• 5.3.6 超滤膜分离效果检验
• 5.4 本章小结
• 参考文献
• 第六章 利用低次烟叶制备烟用香精的研究
• 6.1 引言
• 6.2 材料与方法
• 6.2.1 材料
• 6.2.2 试剂与设备
• 6.2.3 方法
• 6.3 结果与讨论
• 6.3.1 低次烟叶酶解工艺研究
• 6.3.2 Maillard 反应研究
• 6.3.3 烟用香精的液质联用分析
• 6.4 本章小结
• 参考文献
• 结论与展望
• 攻读博士学位期间发表论文情况
• 致谢