血脑屏障通透性改变的TNF-α损伤机制及清开灵的保护作用

论文摘要

脑病发生机制是现代医学研究的热点之一。其中,脑缺血后的炎症过程已经成为研究的重要领域,而血脑屏障（blood brain barrier,BBB）作为这种炎症损伤的病理环节,对于脑缺血后的级联损伤发生了重要影响。中医药治疗多种脑源性疾病具有较好的疗效,特别是对于脑缺血损伤的治疗作用,具有显著的临床优势。本文以脑缺血-再灌注损伤炎症反应中产生的肿瘤坏死因子-α（TNF-α）作为研究切入点,通过应用 TNF-α单克隆抗体阻断大鼠血循环中的 TNF-α,分析脑缺血-再灌注损伤血脑屏障功能及通透性的改变,探讨脑缺血-再灌注损伤的炎性机制。本论文由文献综述和实验研究两部分组成。文献综述主要分析了脑缺血-再灌注损伤血脑屏障通透性现代机制研究的状况,重点阐述了与炎症反应相关的诸多细胞因子在脑缺血-再灌注损伤中的作用,以及血脑屏障在该病理过程中的形态与功能变化,为本实验设计提供了思路与方法。实验研究部分为血脑屏障通透性改变的 TNF-α 损伤机制及清开灵的保护作用研究,包括三方面的内容: 第一部分主要探讨阻断 TNF-α后脑缺血-再灌注损伤血脑屏障通透性变化的特征及清开灵的保护作用。选用健康雄性 Wistar 大鼠,利用双侧颈总动脉夹闭的方法复制大鼠前脑缺血-再灌注模型,分别给予清开灵注射液、TNF-α 抗体及该抗体与清开灵共用。选择再灌注 24h 和 72h 两个时间点,检测脑组织含水量、组织Ⅳ型水通道蛋白（aquaporin-4,AQP4）表达量以及脑微血管内源性白蛋白的渗漏状况,以发掘在缺血-再灌注 BBB 损伤的水液平衡变化病理过程中 TNF-α 的作用,及清开灵解毒通络作用对此病理过程的影响。第二部分探讨了阻断 TNF-α后脑缺血-再灌注损伤血脑屏障相关细胞因子表达的变化,及清开灵对这些因子变化的影响。造模方法和动物分组同第一部分。检测血清 TNF-α、血清可溶性细胞间粘附分子-1（sICAM-1）、血清 p-选择素（p-selectin）含量以及脑组织细胞间粘附分子-1（ICAM-1）表达量,以探讨 TNF-α 对缺血-再灌注 BBB 损伤时相关细胞因子变化的调节机制,以及清开灵的作用特征。第三部分观察阻断TNF-α后脑缺血-再灌注损伤血脑屏障组织病理学特征变化及清开灵的作用。造模方法和动物分组同第一部分。采用石蜡切片 HE 染色光镜观察脑微血管的形态改变,以期揭示TNF-α 是否在脑缺血-再灌注血脑屏障形态学损伤中发挥作用,并探讨清开灵对这种形态学影响的特征。实验研究结果: 一、阻断 TNF-α及应用清开灵可以减轻脑缺血-再灌注脑组织水肿程度 1.阻断 TNF-α及应用清开灵可以阻抑脑组织含水量的升高? 2 ? 血脑屏障通透性改变的 TNF-α 损伤机制及清开灵的保护作用大鼠脑缺血再灌 24h 时,清开灵可降低脑组织含水量来减轻脑水肿,发挥脑保护作用。72h 时,清开灵的这种作用仍较显著。而阻断病理过程中 TNF-α 的作用也显示了优良的阻止脑组织含水量增加的作用,基本保持了正常脑组织含水量的水平,显示 TNF-α在脑缺血-再灌注的 BBB 损伤机制中扮演了重要角色。2.阻断 TNF-α及应用清开灵可以促进Ⅳ型水通道蛋白恢复表达脑缺血再灌 24h 和 72h 时,清开灵可使脑组织 AQP4 不同程度恢复表达,起到了恢复 AQP4 功能的作用,从而间接地保护了血脑屏障,维持了大脑水平衡,且随着时间延长而增强,但这种效应以阻断 TNF-α 更显著。表明 TNF-α 参与了该病理损伤过程,而清开灵的脑保护作用途径并非经单一拮抗 TNF-α 起作用。3.阻断 TNF-α及应用清开灵可以减轻血管内源性白蛋白渗漏清开灵在 24h 和 72h 均可减轻脑组织微血管外内源性白蛋白的表达,即减轻了血脑屏障的损伤,内源性白蛋白向血管外渗漏减少。阻断 TNF-α 更为明显的改善了内源性白蛋白漏出血管外的情况,TNF-α 阻断后清开灵的疗效更为显著。说明清开灵降低受损 BBB 通透性的作用与拮抗 TNF-α 损伤有关,但还有其他作用途径。二、阻断 TNF-α及应用清开灵对脑缺血-再灌注损伤相关细胞因子表达的影响1. 阻断 TNF-α及应用清开灵对脑缺血-再灌注后血清 TNF-α含量的影响脑缺血-再灌注后,血清 TNF-α含量明显升高。再灌注 24h 和 72h,清开灵不能明显降低血清TNF-α含量。缺血-再灌注 24h,未用 TNF-α抗体各组的血清 TNF-α水平均低于应用抗体各组,而缺血-再灌注 72h,情况出现翻转,应用 TNF-α抗体各组血清 TNF-α明显降低。说明,TNF-α单克隆抗体的作用并不是即时效应,而是随着时间延长而作用增强。但是,即时应用抗体,清开灵也未体现出降低血清 TNF-α的作用。说明清开灵对脑缺血-再灌注损伤血脑屏障的保护机制并不是通过调节血中 TNF-α的浓度来实现的。2. 阻断 TNF-α及应用清开灵对脑缺血-再灌注后血清 sICAM-1 含量的影响脑缺血-再灌注后,血清 sICAM-1 含量明显升高,清开灵能够有效地降低外周血 sICAM-1 水平。应用 TNF-α抗体阻断后,血清 sICAM-1 含量显著降低,说明 sICAM-1 的表达与 TNF-α的启动有关。但 TNF-α阻断后未见清开灵降低血 sICAM-1 作用有所增强。这说明虽然应用抗体能够阻断 TNF-α导致的 sICAM-1 升高,但清开灵降低缺血再灌注后产生的 sICAM-1 的作用更显著。3. 阻断 TNF-α及应用清

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中文摘要

ABSTRACT

英文缩略词

上篇文献综述：脑缺血再灌注损伤血脑屏障通透性研究进展

1 血脑屏障结构认识

2 脑缺血-再灌注损伤血脑屏障通透性改变机制研究

2.1 血脑屏障通透性的影响因素

2.1.1 血脑屏障的结构与功能特点

2.1.2 溶质或药物自身的特性

2.1.3 酶系统

2.2 脑缺血再灌注损伤模型血脑屏障通透性的基本改变

2.3 脑缺血-再灌注损伤BBB通透性改变的现代机制

2.3.1 粘附分子（adhe-sion molecules，AMs）与血脑屏障

2.3.2 肿瘤坏死因子-α（TNF-α）

2.3.3 血小板活化因子（Platelet Activating Factor ，PAF）

2.3.4 水通道蛋白（aquaporin，AQP）

2.3.5 紧密连接结构（tight junction，TJ）

2.3.6 基质金属蛋白酶（matrix metallo proteinases，MMPs）

2.3.7 白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）

2.3.8 其它因素

3 BBB通透性形态学研究方法

3.1 组织切片苏木精-伊红（HEMATOXYLIN-EOSIN，H-E）染色光学显微镜观察

3.2 超薄切片透射电镜观察

3.3 免疫组织化学染色法方法

3.4 伊文思蓝（EB）外渗分光光度分析法

3.5 荧光法测定

3.6 示踪法

3.7 CT扫描法

3.8 核磁共振（MRI）及增强MRI法

3.9 阳离子胶体金标记

4 影响脑缺血-再灌注损伤血脑屏障通透性的药物研究

4.1 药物的透过途径和方法

4.2 中医药的优势

5 展望

6 参考文献

下篇实验研究

1 前言

2 实验研究流程图

3 实验一缺血-再灌注脑组织水肿的TNF-Α损伤机制及清开灵的作用

3.1 材料与方法

3.1.1 实验动物与分组

3.1.2 动物模型制备

3.1.3 取材处理

3.1.4 主要试剂

3.1.5 主要仪器

3.1.6 检测指标及方法

3.1.7 统计学处理

3.2 结果

3.2.1 脑组织含水量（见表1-1 和图1-1）

3.2.2 脑组织AQP4 的表达（见表1-2 和图1-2、附图一）

3.2.3 内源性白蛋白（见附图二）

3.3 讨论

3.3.1 脑组织含水量

3.3.2 脑组织AQP4 的表达

3.3.3 血管外内源性白蛋白

3.4 参考文献

4 实验二脑缺血-再灌注相关细胞因子表达的TNF-Α损伤机制及清开灵的作用

4.1 材料与方法

4.1.1 实验动物与分组

4.1.2 动物模型制备

4.1.3 取材处理

4.1.4 主要试剂

4.1.5 主要仪器

4.1.6 检测指标及方法

4.1.7 统计学处理

4.2 结果

4.2.1 血清TNF-α含量（见表2-1 和图2-1）

4.2.2 血清P-selectin含量（见表2-2 和图2-2）

4.2.3 血清sICAM-1 含量（见表2-3 和图2-3）

4.2.4 脑组织ICAM-1 含量（见表2-4 和图2-4）

4.3 讨论

4.3.1 TNF-α

4.3.2 P-selectin

4.3.3 ICAM-1

4.4 参考文献

5 实验三脑缺血-再灌注损伤血脑屏障形态学变化的TNF-Α损伤机制及清开灵的作用

5.1 材料与方法

5.1.1 实验动物与分组

5.1.2 动物模型与制备

5.1.3 取材处理

5.1.4 主要试剂与药物

5.1.5 主要仪器

5.1.6 形态学观察

5.2 结果

5.3 讨论

5.4 参考文献

小结

致谢

简历

附图一脑微血管AQP4 免疫组织化学标记照片

附图二脑组织白蛋白免疫组织化学照片

附图三脑组织ICAM-1 免疫组织化学标记照片

附图四脑组织HE染色照片

血脑屏障通透性改变的TNF-α损伤机制及清开灵的保护作用

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