花球发育调控机制的研究

论文题目: 花球发育调控机制的研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 遗传学

作者: 曹文广

导师: 何玉科

关键词: 芸苔属,花球,可变剪接,酵母双杂交,分子进化,甘蓝种,芸苔种

文献来源: 中国科学院研究生院（上海生命科学研究院）

发表年度: 2005

论文摘要: 花椰菜(Brassica oleracea var. botrytis)花球是白色光滑的半球状结构,内部是短缩的分枝,表面是大量增生的分生组织。这些分生组织大多数都是未决定的花序分生组织。青花菜(Brassica oleracea var. italica)的花球与花椰菜花球的差异在于其表面是由大量增生的、处于分化状态但暂时不能开放的花蕾组成。花椰菜和青花菜的花球发育到一定阶段之后,就会抽苔,并产生正常的花蕾。前人的研究结果表明,花椰菜花球的发生与BobCAL(BobCAULIFLOWER)基因的突变有关。但是,关于BobCAL基因如何调控花球的形态发生的问题,因为缺乏直接证据却一直存在争议。研究花椰菜花球形成的分子机制不仅可以加深对花分生组织分化的调控机制的理解,也为更好地利用基因工程手段调节花球这一重要的农艺性状打下了基础。在众多花椰菜纯系中,我们分离出4种不同基因型的花椰菜:光滑花球(smooth curd, sc),刺状花球(thorny curd, tc)、晶体状花球(crystal curd, cc)和毛状花球(hairy curd, hc)。显微观察表明,sc光滑花球的表面着生数量可观的花序分生组织,tc刺状花球的表面除花序分生组织外还夹杂着一些微小的茎生叶,cc晶体状花球表面则布满裸露的花分生组织,hc毛状花球表面的花分生组织中有一部分已带有萼片原基。为了证实花椰菜BobCAL基因的第五个外显子中存在的终止突变是花椰菜花球形成的原因,我们将甘蓝全长的BoCAL基因导入花椰菜,以互补花椰菜中突变的BobCAL的功能缺失。结果发现,转基因花椰菜不形成花球结构,而是直接分化绿色的花蕾。这就意味着,由BobCAL功能缺失所导致的花球表型被甘蓝BoCAL基因互补了,BobCAL的提前终止突变是导致花椰菜花球形成的原因。然而,对基因序列的测定分析使我们发现,在hc和cc花椰菜中存在两个拷贝的BobCAL基因:没有终止突变的BobCAL-G和有终止突变的BobCAL-T,而sc和tc花椰菜中只有BobCAL-T。青花菜中也存在两个拷贝的BoiCAL基因:BoiCAL-G和BoiCAL-T,这可能是毛状花球的表型和青花菜表型相似的原因所在。而毛状花球花椰菜和青花菜花球的形成可能是由于BobCAL-T的存在影响了BobCAL-G的功能,但也不排除还有其它基因在调节花球的形成。花发育相关基因的表达分析表明,BobTFL1(BobTERMINAL FLOWER 1)基因在sc和cc花球增大期高水平表达,而BobLFY(BobLEAFY)的表达很弱;与此相比,BobTFL1基因在tc和hc花球增大期的表达呈现减弱的趋势,而BobLFY基因表现为增强。较高的BobLFY的表达水平和较高的BobLFY/BobTFL1的比例可能是晶体状花球和毛状花球形态发生的原因。在hc和cc花球中全长BobCAL-G的存在提高了BobTFL/BobLFY表达水平的比值。在花椰菜中存在BobCAL基因的可变剪接机制。我们在sc和tc基因型中各发现4种剪接异构体,并根据长度将它们分别命名为BobCAL-Ta,BobCAL-Tb,BobCAL-Tc和BobCAL-Td。而在hc和cc基因型中发现有8种BobCAL基因的可变剪接异构体,它们分别来自于BobCAL-G和BobCAL-T两个拷贝。序列分析表明,除BobCAL-Ga/Ta外,其它三种异构体中都保留了部分内含子的序列。基因表达分析表明,花椰菜BobCAL的剪接异构体在花球发育的不同时期的相对丰度不同,说明BobCAL基因通过产生不同功能的蛋白来调节花发育的过程。在青花菜中,BoiCAL也产生8种剪接异构体。RT-PCR分析表明,BoiCAL的剪接异构体在花球的花蕾和抽苔后的花蕾的花器官中有不同的表达模式,这种BoiCAL的表达差异可能是造成花球的花蕾不能开放而抽苔后花蕾能够开放的原因。为了研究BobCAL的不同剪接异构体的编码产物的功能差异,我们将4种BobCAL蛋白的编码序列分别转化拟南芥Ler和Ws生态型,研究它们过量表达是会产生什么表型;同时将它们导入拟南芥的ap1和ap1 cal突变体中研究它们能够在什么程度上回复突变体的表型。通过浸染法转化拟南芥,我们已经获得了各自的转化株系,进一步的表型分析还在进行中。SEPALLATA3 (SEP3)基因决定花瓣、雄蕊和心皮三轮花器官,而花椰菜花球上的后三轮花器官则停滞发育。为了研究不同长度的BobCAL蛋白是否还具有和BobSEP3蛋白相互作用的能力,我们从花椰菜花球中克隆了BobSEP3基因,并针对BobCAL蛋白与BobSEP3蛋白间进行了酵母双杂交分析。初步结果显示,三个截断(truncated)BobCAL蛋白与BobSEP3有结合反应,与此相比,全长的BobCAL与BobSEP3的结合活力较弱。BobCAL截断蛋白与BobSEP3形成的复合物是没有功能的,可能影响BobSEP3对花瓣、雄蕊和心皮三轮花器官的决定作用。另外,我们对从芸苔属植物中克隆的CAL同源基因进行了多态性位点的分析和系统发育分析,结果表明甘蓝种的变种可以分为进化上独立的两组:boi类甘蓝和aco类甘蓝。与此相比,菜苔和甘蓝的亲缘关系比和芸苔种更近。

论文目录:

中文摘要

英文摘要

第一部分 文献综述

花分生组织决定的调控机制

1 花分生组织分化相关的基因

1.1 花序分生组织属性基因—TFL1（TERMINAL FLOWER 1）基因

1.2 花分生组织属性基因

1.2.1 LFY（LEAFY）基因

1.2.2 AP1（APETALA1）基因

1.2.3 CAL（CAULIFLOWER）基因

1.2.4 FUL（FRUITFULL）基因

1.2.5 AG（AGAMOUS）基因

2. 开花时间途径对花分生组织分化的影响

2.1 开花时间途径对花分生组织属性基因表达的调控

2.2 开花时间基因调节植物对花分生组织属性基因的响应

3. 花分生组织决定的遗传调控

3.1 花分生组织属性基因之间的相互作用

3.2 LFY 基因的表达上调是开花起始和花分生组织决定的必要条件

3.3 花分生组织属性决定的调控机制

3.3.1 花分生组织属性基因与TFL1 的调控关系

3.3.2 花分生组织属性的决定

3.3.3 花分生组织异常增生与LFY 和TFL1 的重叠表达

3.3.4 花分生组织决定性（determinacy）的调控

4. 结束语

参考文献

花椰菜花球形成的分子机制研究进展

1 花椰菜的演变和进化

2 花椰菜的生物学特性

2.1 花椰菜的生物学特征

2.2 花椰菜的发育过程

3. 花椰菜花球的发育模式

3.1 花椰菜花球的解剖结构

3.2 花椰菜花球的发育

3.2.1 器官发生模式

3.2.2 分枝模式

3.2.3 花序模式

3.3 花椰菜花球是一种开花逆转现象

3.4 花椰菜花球发育受到环境与生理条件的影响

4. 花椰菜花球发育的分子机制

4.1 拟南芥花球表型及分子调控

4.2 花椰菜花球与拟南芥cauliflower 突变表型之间的区别

4.3 花椰菜的BobCAL 和BobAP1 基因

4.4 花椰菜花球分化的分子调控模型

5. 结束语

参考文献

第二部分 研究论文

第一章 花椰菜花球形成的分子机制研究

引言

1. 材料与方法

1.1 植物材料

1.2 试剂

1.3 常用载体及菌株

1.4 基本实验方法

1.5 培养基的配制

1.6 植物表达载体的构建

1.7 BobCAL 的酵母双杂交载体的构建

1.8 花椰菜 BobSEP3基因的克隆及其酵母双杂交载体的构建

1.9 花椰菜的遗传转化

1.10 拟南芥的转化与筛选

1.11 植物基因组DNA 的提取

1.12 植物总RNA 的提取

1.13 转基因植株的PCR 鉴定

1.14 转基因花椰菜的Southern 杂交鉴定

1.15 XhoI-RFLP 分析

1.16 转基因花椰菜植株的Km 抗性筛选

1.17 CAL 同源基因cDNA 的克隆和鉴定

1.18 花椰菜和转基因花椰菜的电镜观察

1.19 RT-PCR 分析

1.20 酵母双杂交中蛋白相互作用的分析方法

1.21 序列测定及分析方法

2. 实验结果

2.1 花椰菜花球的形态和发育过程分析

2.2 花发育相关基因在花椰菜花球增大期的表达分析

2.3 转外源BoCAL 基因花椰菜的获得

2.4 转外源BoCAL 基因花椰菜的表型分析

2.5 外源BoCAL 基因在转基因花椰菜中的表达分析

2.6 转基因花椰菜中BoCAL 和花分生组织发育相关基因的表达分析

2.7 花椰菜中BobCAL cDNA 的克隆

2.8 BobCAL 可变剪接方式分析

2.9 花球突变体和不同成熟期的花椰菜BobCAL cDNA 的克隆与分析

2.10 BobCAL 编码蛋白的序列和结构分析

2.11 BobCAL 基因在花球发育不同时期的表达方式

2.12 其它甘蓝植物CAL 同源基因的可变剪接分析

2.13 拟南芥转化载体的构建

2.14 转基因拟南芥的获得和分子鉴定

2.15 花椰菜BobSEP3 基因的克隆

2.16 酵母双杂交方法研究BobCAL 和BobSEP3 的相互作用

3. 讨论

3.1 可变剪接机制可能参与调节甘蓝类植物CAL 同源基因的功能

3.2 花椰菜BobCAL 中的终止突变在花椰菜花球形成中的作用

3.3 花球调控机制在拟南芥和花椰菜中的保守性

参考文献

第二章 青花菜BoiCAL 基因的可变剪接及其功能的初步分析

引言

1. 材料与方法

1.1 实验材料

1.2 基因组DNA 的提取

1.3 BoiCAL 基因的PCR 扩增及克隆

1.4 青花菜总RNA 的提取

1.5 BoiCAL 基因cDNA 的克隆与分析鉴定

1.6 序列测定和分析

1.7 半定量RT-PCR 分析

2. 实验结果

2.1 青花菜花球的结构及其发育过程

2.2 青花菜BoiCAL cDNA 的克隆

2.3 青花菜BoiCAL cDNA 的序列分析

2.4 青花菜BoiCAL 蛋白的结构预测与分析

2.5 BoiCAL 及花发育相关基因在青花菜花球发育中的表达分析

3. 讨论

参考文献

第三章 芸苔属CAL 同源基因的分子进化分析

引言

1. 材料与方法

1.1 材料来源

1.2 植物基因组DNA 的提取

1.3 PCR 扩增所用引物的设计

1.4 芸苔属CAL 同源基因的扩增与克隆

1.5 序列分析

2. 结果与分析

2.1 CAL 同源基因的克隆

2.2 CAL 同源基因的序列分析

2.3 芸苔属芸苔种和甘蓝种的系统发育关系

3. 讨论

参考文献

附图1

发表文章

致谢

发布时间: 2007-08-15

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