微生物源硝基还原酶催化化学单元反应的研究

论文摘要

硝基还原成氨基是常见的化学单元反应。将硝基还原酶作为此反应的催化剂,与化学还原法相比,可以使反应条件变得温和、安全。在建立的微生物源硝基还原酶筛选模型上,从众多微生物菌株中筛选到一株细菌No.134。经过高效液相色谱分析和液质联用仪鉴定,其培养液能将重要的农药中间体对-（N-苯基甲酰基）邻硝基苯甲醚转化成对-（N-苯基甲酰基）邻胺基苯甲醚。将菌株No.134进行16SrDNA的测序。测序结果表明,该菌株与芽孢杆菌属相比其核苷酸序列相似度为99.2%。经诱变育种、条件优化等初步生物学研究,使菌株培养液中的酶活性与起始菌株相比提高了109%。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 文献综述
• 1.1 硝基还原酶的背景资料
• 1.1.1 微生物降解硝基化合物的过程和反应机制的研究
• 1.1.2 来自微生物的硝基还原酶催化还原反应机理及分布研究
• 1.1.3 人们对来自不同菌属的硝基还原酶的特性进行研究
• 1.1.4 对硝基还原酶基因调节的研究
• 1.1.5 对硝基还原酶结构和功能的研究
• 1.1.6 硝基还原酶的应用研究
• 1.2 立题背景及其研究意义
• 第2章 实验设计与方案
• 2.1 产生硝基还原酶的微生物菌株的筛选
• 2.2 使用薄层层析方法来筛选产硝基还原酶的微生物菌株
• 2.3 HPLC分析方法的建立
• 2.4 运用LC/MS方法来确定菌株培养液能还原底物成对--（N-苯基甲酰基）邻胺基苯甲醚
• 2.5 菌株生理生化特性测定
• 2.6 16SrDNA序列测定
• 2.7 菌株酶反应条件的优化
• 2.8 菌株酶活的提高
• 第3章 产物对--（N-苯基甲酰基）邻胺基苯甲醚的分析方法研究
• 3.1 试验材料和方法
• 3.1.1 仪器与试剂
• 3.1.2 高效液相色谱条件
• 3.1.3 标准曲线的绘制
• 3.1.4 分析样品的预处理
• 3.2 测定与计算
• 3.2.1 外标法测定步骤
• 3.2.2 效价计算
• 3.2.3 精密度计算
• 3.2.4 测定方法的准确度
• 3.3 结果与讨论
• 第4章 产硝基还原酶菌种的筛选
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.1.1 菌种来源
• 4.1.1.2 主要仪器和试剂
• 4.1.2 实验方法
• 4.1.2.1 在培养平皿上用化学显影法的初步筛选
• 4.1.2.2 用薄层层析法初步筛选微生物菌株
• 4.1.2.3 使用HPLC法对微生物菌株的复筛
• 4.1.2.4 菌种No.134酶反应生成物的结构鉴定
• 4.2 实验结果
• 4.2.1 化学显影法的初步筛选
• 4.2.2 薄层层析法初步筛选微生物菌株
• 4.2.3 使用HPLC法对微生物菌株的复筛
• 4.2.4 菌种No.134酶反应生成物的结构鉴定
• 第5章 细菌134的菌种分类
• 5.1 材料试剂及仪器
• 5.1.1 材料
• 5.1.1.1 菌株
• 5.1.1.2 培养基
• 5.1.2 其他药品与试剂
• 5.1.3 主要仪器
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 菌株生理生化特性测定
• 5.2.1.1 明胶液化
• 5.2.1.2 牛奶凝固和胨化测定
• 5.2.1.3 淀粉水解测定
• 5.2.1.4 纤维素水解
• 5.2.1.5 硫化氢产生实验
• 5.2.1.6 酪氨酸水解
• 5.2.1.7 碳源利用试验
• 5.2.2 16S DNA的抽提、测序和分析
• 5.2.2.1 菌丝体的裂解
• 5.2.2.2 PCR扩增
• 5.2.2.2.1 PCR扩增引物
• 5.2.2.2.2 反应混合液
• 5.2.2.2.3 PCR反应条件
• 5.2.2.3 琼脂糖凝胶电泳
• 5.2.2.3.1 溶液配制及制胶
• 5.2.2.3.2 电泳方法
• 5.2.2.4 DNA的回收
• 5.2.2.5 TG1感受态细胞的制备
• 5.2.2.6 载体与载体连接
• 5.2.2.6.1 pUCm-T载体
• 5.2.2.6.2 载体连接
• 5.2.2.7 转化
• 5.2.2.8 质粒的抽提
• 5.2.2.9 质粒DNA酶切及验证
• 5.2.2.9.1 酶切
• 5.2.2.9.2 电泳
• 5.2.2.9.3 测序
• 5.2.2.9.4 系统发育树分析
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 菌株134的生理生化特征
• 5.3.2 16SrDNA系统发育树分析
• 第6章 提高菌种No.134产酶活性的研究
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 实验材料
• 6.1.1.1 菌种来源
• 6.1.1.2 主要仪器和试剂
• 6.1.2 实验方法
• 6.1.2.1 菌株134的硝基还原酶的反应特性
• 6.1.2.1.1 菌株134产生的硝基还原酶在培养液的分布
• 6.1.2.1.2 不同反应温度和PH对酶活性的影响
• 6.1.2.1.3 No.134菌株对不同底物的降解
• 6.1.2.2 对菌种进行诱变育种
• 6.1.2.2.1 菌种紫外处理
• 6.1.2.2.2 菌种微波处理
• 6.1.2.2.3 使用硫酸二乙酯和氯化锂进行诱变
• 6.1.2.2.4 使用吖啶黄进行菌种处理
• 6.1.2.3 对菌种培养过程进行优化
• 6.1.2.3.1 诱变菌种No.134-13对各种碳源利用的研究
• 6.1.2.3.2 诱变菌种No.134-13对各种氮源利用的研究
• 6.1.2.3.3 诱变菌种No.134-13的培养基中氮源与培养时间的研究
• 6.1.2.3.4 微量无机金属离子对于菌株No.134-13产酶活性的影响
• 6.2 实验结果
• 6.2.1 菌株134产生的硝基还原酶在培养液的分布
• 6.2.2 不同反应温度和PH对酶活性的影响
• 6.2.3 No.134菌株对不同底物的降解
• 6.2.4 对菌种进行诱变育种
• 6.2.4.1 菌种紫外处理
• 6.2.4.2 菌种微波处理
• 6.2.4.3 使用硫酸二乙酯和氯化锂进行诱变
• 6.2.4.4 使用吖啶黄进行菌种处理
• 6.2.5 对菌种培养过程进行优化
• 6.2.5.1 诱变菌种No.134-13对各种碳源利用的研究
• 6.2.5.2 诱变菌种No.134-13对各种氮源利用的研究
• 6.2.6 诱变菌种No.134-13的培养基中氮源组合与培养时间的研究
• 6.2.7 各种微量无机金属离子对于菌株No.134-13产酶活性的影响
• 第7章 结论及展望
• 参考文献
• 致谢