乳酸菌胞外多糖生物合成及提高免疫力的研究

论文摘要

该研究主要内容为高产胞外多糖（exopolysaccharide,EPS）乳酸菌的筛选、培养基的确定、培养条件的优化及乳酸菌胞外多糖在增强免疫功能方面的作用。另外，利用干酪在加工过程中的副产物乳清来合成胞外多糖。以发酵乳制品、酸菜、泡菜等为样品，进行了乳酸菌菌种的活化、分离、纯化，共分离到乳酸菌20株。对分离到的乳酸菌进行胞外多糖高产菌株的筛选，结果筛选出植物乳杆菌为高产EPS的乳酸菌。根据多糖的产量，从MRS、ATP、SL、Eiller培养基中选择高产胞外多糖的Eiller培养基作为植物乳杆菌合成EPS的基本培养基。并对碳源、氮源、盐等对该菌株EPS生物合成的影响进行了研究。从而开发出用于植物乳杆菌EPS生物合成研究的新型合成培养基（命名为E1），该培养基的组成为：普通蛋白胨13.3g、蔗糖13.3g、葡萄糖13.3g、酵母提取物5.0g、氯化钠4.0g、明胶2.5g、乙酸钠1.5g、抗坏血酸0.5g、去离子水1000mL。选择适当的培养条件，根据单因素实验结果设计L9（34）正交试验，确定最佳发酵条件为：初始pH为5.2，45℃发酵22h，。粗多糖含量为881.90mg/L。经提取的粗多糖，依次经DEAE-52纤维素层析和SephadexG-100凝胶层析分离，样品浓度10mg/ml，上样量为3ml，流速15ml/h，3ml/管分部收集，用凝胶柱层析法测得EPSⅠ的平均分子量为EPSⅠ的分子量为1.5×105，EPSⅡ的分子量为1.1×104。急性毒性实验表明，植物乳杆菌EPS安全无毒。动物实验结果表明：与NS组相比，多糖组可以显著提高小鼠脾脏、胸腺的重量和吞噬指数（P<0.05或P<0.01），表明EPS可以促进非特异性免疫功能；粗多糖高剂量组可以可使小鼠足跖肿胀度明显增加，差异具有显著性（P<0.05或P<0.01），表明EPS对小鼠的细胞免疫功能有促进作用；纯多糖高剂量组和粗多糖高、低剂量组可以显著的降低小鼠的血清溶血值（P<0.05或P<0.01），表明EPS可增强体液免疫功能；纯多糖高剂量组和粗多糖高剂量组可以显著的提高T淋巴细胞的增殖（P<0.01），表明能提高T淋巴细胞的免疫应答。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1.1 乳酸菌
• 1.1.1 乳酸菌简介
• 1.1.2 乳酸菌的生理特征
• 1.1.3 乳酸菌的主要生理作用
• 1.1.4 植物乳杆菌
• 1.2 多糖
• 1.2.1 多糖简介
• 1.2.2 微生物胞外多糖
• 1.3 乳酸菌胞外多糖
• 1.3.1 乳酸菌胞外多糖的分类
• 1.3.2 乳酸菌胞外多糖的结构
• 1.3.3 乳酸菌胞外多糖的化学组成
• 1.3.4 乳酸菌胞外多糖的生物合成
• 1.3.5 乳酸菌胞外多糖合成中的遗传调控
• 1.4 影响乳酸菌胞外多糖合成的因素
• 1.4.1 菌株遗传特性的影响
• 1.4.2 培养基
• 1.4.3 温度
• 1.4.4 时间
• 1.4.5 pH 值
• 1.4.6 氧分压
• 1.5 乳酸菌胞外多糖的分离纯化
• 1.6 乳酸菌胞外多糖的生理作用
• 1.6.1 抗肿瘤作用
• 1.6.2 免疫调节作用
• 1.6.3 对消化道功能的调节作用
• 1.6.4 乳酸菌胞外多糖对细胞体的保护
• 1.7 乳酸菌胞外多糖在发酵乳方面的应用
• 1.8 本研究目的意义
• 1.9 本研究主要内容
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 试剂与药品
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 仪器与设备
• 2.1.4 菌株
• 2.1.5 动物实验
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 乳酸菌的分离
• 2.2.2 高产胞外多糖乳酸菌的筛选
• 2.2.3 EPS 醇沉条件的确定
• 2.2.4 EPS 脱蛋白实验的研究
• 2.2.5 EPS 生物合成条件的研究
• 2.2.6 高产 EPS 乳酸菌的最适培养条件的确定
• 2.2.7 利用干酪副产物乳清生产 EPS 的研究
• 2.2.8 胞外多糖的初步分离
• 2.2.9 EPS 毒性及免疫功能的研究
• 2.3 测定方法
• 2.3.1 EPS 的测定
• 2.3.2 EPS 中蛋白值含量的测定
• 第三章 结果与讨论
• 3.1 高产胞外多糖乳酸菌菌株的筛选
• 3.2 EPS 醇沉条件的确定
• 3.3 EPS 脱蛋白实验的研究
• 3.3.1 Sevag 法脱蛋白
• 3.3.2 三氯乙酸法脱蛋白
• 3.3.3 酶法脱蛋白
• 3.3.4 酶法脱蛋白最佳条件的优化
• 3.4 EPS 生物合成条件的研究
• 3.4.1 最适生长基本培养基的确定
• 3.4.2 碳源的影响
• 3.4.3 氮源的影响
• 3.4.4 碳氮比的影响
• 3.4.5 盐类的影响
• 3.4.6 培养基初始 pH 值的影响
• 3.4.7 温度的影响
• 3.4.8 时间的影响
• 3.4.9 接种量的影响
• 3.5 高产 EPS 乳酸菌的最适培养条件的确定
• 3.6 利用干酪副产物乳清生产 EPS 的研究
• 3.7 胞外多糖分离纯化的研究
• 3.7.1 多糖的制备
• 3.7.2 EPS 的紫外全波长扫描
• 3.7.3 DEAE-52 纤维素柱层析分离纯化
• 3.7.4 Sephadex G-200 柱层析纯化
• 3.7.5 Sephadex G-100 柱层析纯化
• 3.7.6 乳酸菌胞外多糖分子量的测定
• 3.8 EPS 毒性及免疫功能的研究
• 3.8.1 急性毒性试验
• 3.8.2 脏器／体重比值测定
• 3.8.3 迟发型变态反应（DTH）（足跖增厚法）
• 3.8.4 小鼠廓清指数实验
• 3.8.5 小鼠血清溶血值测定
• 3.8.6 淋巴细胞增殖功能检测
• 第四章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 在读期间发表的文章