PGE2上调AREG表达促进胆管癌细胞生长的机制研究

论文摘要

研究背景：前列腺素E2（PGE2）是花生四烯酸经过环氧合酶-2（COX-2）催化的代谢产物，通过四种特异膜G蛋白偶联受体（EP1、EP2、EP3和EP4）发挥作用。可以促进肿瘤细胞增殖、肿瘤的血管形成]和侵袭转移。双调蛋白（AREG）是表皮生长因子（EGF）家族成员之一，由252个氨基酸组成的跨膜前体（pro-AREG）通过ADAM-17剪切后与其受体EGFR结合，激活一系列下游信号转导通路，在不同类型肿瘤细胞中都表现出促进增值及抑制凋亡作用。有报道，在正常的肝组织中几乎检测不到AREG的表达，而在肝硬化及肝癌组织中表达明显增高，并在肝癌细胞的增殖，侵袭，转移，血管形成中发挥重要作用。本实验室前期工作证明，PGE2可以促进胆管癌CCLP1细胞的增殖，而目前在肝癌中，AREG和PGE2之间是否存在调节关系以及在CCLP1细胞增殖能力调控中的作用机制目前还不清楚。本研究应用PGE2、四种EP受体激动剂、AC拮抗剂SQ22536及PKA抑制剂H89等处理人胆管上皮癌细胞CCLP1，观察其AREG表达水平的变化及与CCLP1细胞增殖能力变化的关系，意在阐明AREG蛋白在PGE2调控CCLP1细胞生长中的作用及其可能的信号转导通路。研究目的：1.研究PGE2对胆管癌细胞CCLP1中AREG蛋白表达的影响及其调节机制。研究方法：1.细胞培养：常规方法培养胆管细胞癌细胞株CCLP1细胞。2.外源性PGE2或四种EP受体激动剂（17-phenyltrinorProstaglandinE2、Butaprost、Sulprostone和ProstaglandinE1Alcohol）处理CCLP1细胞，Westernblot实验检测AREG蛋白水平的变化。3.外源性PGE2处理CCLP1细胞0h、24h、36h、48h，WST实验检测CCLP1细胞的增殖能力。4.设对照组、PGE2处理组、PGE2+AREG中和抗体Mab262，SAB1402118处理组，WST检测AREG在PGE2诱导的CCLP1细胞增殖中的作用5.设对照组、PGE2处理组、PGE2+SQ22536（腺苷酸环化酶抑制剂）处理组、PGE2+H89（PKA抑制剂）处理组，Westernblot验检测AREG蛋白水平的变化。6.外源性PGE2、AH6809（EP2受体拮抗剂），H89处理及质粒（CMV500-DN-CREB）转染CCLP1细胞，Westernblot验检测CREB蛋白磷酸化水平的变化研究结果：1.以DMSO为对照，用1μM、5μM、10μM外源性PGE2处理CCLP1细胞24h，Westernblot实验发现AREG的表达量与对照组相比分别增加了13.4%、28.5%、44.2%（P<0.05）。2.以DMSO为对照，用5μMPGE2处理CCLP1细胞24h、36h、48h，WST结果显示CCLP1细胞的增殖能力分别增长了13.9%、34.3%、15.1%（P<0.05）;而用两种AREG中和抗体Mab262，SAB1402118处理1h后再加入5μMPGE2继续处理至36h，PGE2诱导的CCLP1细胞增殖可被AREG中和抗体抑制，分别下降了18%、20%（P<0.01）。3.以DMSO为对照，实验组分别用10μM外源性EP1、EP2、EP3、EP4受体激动剂处理24h，Westernblot实验观察到EP2受体激动剂组AREG蛋白水平升高了20.1%，P<0.05，而EP1、EP3、EP4组则未见明显增高。用1μM、5μM、10μMEP2受体激动剂处理CCLP1细胞后，AREG蛋白的表达量分别升高了30.5%、31.2%、37.6%（P<0.05），而CCLP1细胞的增殖能力分别上升了10.5%、14.9%、16.1%（P<0.05），而用EP2拮抗剂AH6809预处理CCLP1细胞后再用EP2激动剂刺激，则AREG的表达较对照组EP2激动剂组下降了约20%（P<0.05）。4.以DMSO为对照，实验组分别用10μMPGE2、10μMButaprost和100μMAC抑制剂SQ22536、10μMPKA抑制剂H89预处理1h后再加入10μMPGE2处理24小时，Westernblot实验结果表明，SQ22536、H89显著抑制了CCLP1细胞中PGE2诱导的AREG蛋白表达升高，SQ22536、H89处理组较对照组（PGE2组）分别降低了46.6%、54.4%（P<0.05）。5.DMSO为对照，实验组分别用10ΜmPGE2和10μMEP2受体拮抗剂AH6809、10μMPKA抑制剂H89预处理1h后再加入10μMPGE2继续处理30min，Westernblot实验结果显示PGE2处理组细胞中CREB蛋白的磷酸化水平较对照组（DMSO组）上升了26.9%，而H89+PGE2处理组较单纯PGE2处理组细胞中CREB蛋白的磷酸化水平下降了45.5%（P<0.05）。6.以10μMPGE2处理CMV500-DN-CREB质粒瞬时转染CCLP1细胞，和以空载CMV500质粒转染的对照CCLP1细胞，以Westernblot实验检测AREG蛋白的水平，结果表明，PGE2能上调空载对照转染组AREG的表达，而不能上调CMV500-DN-CREB转染组AREG的表达。研究结论：本研究结果表明，PGE2能够上调CCLP1细胞AREG蛋白的表达，从而促进CCLP1细胞的增殖，此作用可能是通过EP2R/Gs/cAMP/PKA/CREB信号转导通路实现。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 参考文献
• 材料与方法
• 实验结果
• 讨论
• 研究小结
• 参考文献
• 文献综述
• 参考文献
• 攻读学位期间发表文章情况
• 致谢