共轭亚麻酸对子宫内膜癌细胞凋亡的影响

论文摘要

共轭亚麻酸（Conjugated linolenic acid, CLnA）是十八碳多不饱和脂肪酸的一组位置和几何异构体,具有抑制肿瘤形成、增强机体免疫力和影响脂代谢等功能。石榴酸（c9,t11,c13-CLnA, punicic acid, PA）和a-桐酸（c9,t11,t13-CLnA, alpha-eleostearic acid, α-ESA）是共轭亚麻酸的两种常见异构体。本文通过分步结晶法提取并纯化了石榴酸,研究了石榴酸和α-桐酸对子宫内膜癌细胞RL95-2凋亡的影响,并对其作用机制进行了初步探讨。首先通过单因素试验,分别研究了-18℃、4℃、25℃条件下,结晶时间对石榴酸纯度的影响。结果为：-18℃条件下结晶时间1h；4℃条件下结晶时间2h；25℃条件下结晶时间16h,乙醇与脂肪酸的比为1：2（v/v）时,石榴酸纯度可以达到95.2%。进一步分析了石榴酸和α-桐酸对子宫内膜癌细胞凋亡的影响。MTT分析结果显示,在10μM至160μM的浓度范围内,石榴酸和α-桐酸处理人子宫内膜癌细RL95-248小时,能够明显抑制细胞活力,其作用呈现时间依赖性和剂量依赖性。石榴酸和α-桐酸的半数致死浓度（IC50）分别为30μM和60μM。应用Hoechst荧光染色荧光显微镜观察细胞核形态变化,石榴酸和α-桐酸处理48h后,细胞核体积明显变小,并呈现皱缩致密的颗粒状的强荧光,可见核固缩或断裂碎片。应用流式细胞术分析石榴酸和α-桐酸对细胞凋亡的影响,发现石榴酸和α-桐酸能够诱导人子宫内膜癌细胞RL95-2的凋亡。40μM的石榴酸和α-桐酸处理细胞48h,凋亡率分别为68.24%和44.91%。应用蛋白免疫印迹分析,发现石榴酸和α-桐酸能够上调Bax、活性型caspase-3、p53凋亡相关蛋白和降低了Bcl-2凋亡相关蛋白的表达。此外,α-桐酸和石榴酸还能够上调PPARy蛋白的表达。综上,本文应用分步结晶法提取并纯化了石榴酸,发现石榴酸和α-桐酸能够显著诱导子宫内膜癌RL95-2细胞的凋亡,其作用可能与对Bax、Bcl-2、caspase-3、p53等凋亡相关蛋白及脂质过氧化相关蛋白PPARy表达的调控有关。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 共轭亚麻酸简介
• 1.2 石榴酸
• 1.2.1 石榴酸的分子结构和来源
• 1.2.2 石榴酸的制备
• 1.2.2.1 低温结晶法
• 1.2.2.2 尿素包合法
• 1.2.2.3 超临界流体萃取法
• 1.2.3 石榴酸的表征
• 1.2.3.1 GC法表征CLnA
• 1.2.3.2 HPLC法表征CLnA
• 1.2.4 石榴酸的生理功能
• 1.2.4.1 石榴酸的代谢
• 1.2.4.2 脂质过氧化
• 1.2.4.3 调节脂代谢
• 1.2.4.4 抗癌抗肿瘤
• 1.3 细胞凋亡
• 1.3.1 细胞凋亡的生物学特征
• 1.3.1.1 形态学变化
• 1.3.1.2 生物化学变化
• 1.3.2 细胞凋亡相关蛋白及信号通路
• 1.3.2.1 Bcl-2家族
• 1.3.2.2 Caspase家族
• 1.3.2.3 p53蛋白
• 1.3.2.4 PPARγ
• 1.3.3 细胞凋亡的过程及机理
• 1.3.3.1 凋亡的启动阶段
• 1.3.3.2 凋亡的执行
• 1.3.4 细胞凋亡的检测
• 1.3.4.1 形态学检测
• 1.3.4.2 流式细胞仪定量分析
• 1.4 立题背景和研究意义
• 1.5 本论文的研究目的和研究内容
• 1.5.1 研究目的
• 1.5.2 研究内容
• 第二章 石榴酸的制备和纯化
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.2 实验设备
• 2.2.3 实验方法
• 2.2.3.1 工艺流程
• 2.2.3.2 低温重结晶纯化石榴酸
• 2.2.3.4 石榴酸甲酯化
• 2.2.3.5 气相色谱分析
• 2.2.3.6 石榴酸纯化单因素试验
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 -18℃条件下结晶时间对石榴酸纯度的影响
• 2.3.2 4℃结晶时间对石榴酸纯度的影响
• 2.3.3 25℃条件下结晶时间对石榴酸纯度的影响
• 2.3.4 气相色谱分析石榴酸的纯度
• 第三章 石榴酸对人子宫内膜癌细胞RL95-2凋亡的影响
• 3.1 前言
• 3.2 实验材料及试剂
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 仪器设备
• 3.2.3 试剂配制
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 细胞培养
• 3.3.1.1 子宫内膜癌细胞的复苏
• 3.3.1.2 子宫内膜癌细胞的传代
• 3.3.1.3 子宫内膜癌细胞的冻存
• 3.3.2 MTT法检测共轭亚麻酸对细胞的生长的影响
• 3.3.3 荧光染色凋亡细胞核形态观察
• 3.3.4 流式细胞术分析RL95-2细胞凋亡
• 3.3.5 Western blot检测凋亡相关蛋白
• 3.3.5.1 裂解细胞
• 3.3.5.2 SDS-PAGE电泳
• 3.3.5.3 转膜
• 3.3.5.4 封闭
• 3.3.5.5 一抗孵育
• 3.3.5.6 洗去一抗
• 3.3.5.7 二抗孵育
• 3.3.5.8 洗去二抗
• 3.3.5.9 ECL显色
• 3.3.6 统计学分析
• 3.4 结果
• 3.4.1 PA 和α-ESA对RL95-2细胞增殖的影响
• 3.4.2 荧光显微镜检测PA和α-ESA对RL95-2细胞凋亡的影响
• 3.4.3 流式细胞仪检测PA和α-ESA对RL95-2细胞凋亡的影响
• 3.4.4 PA和α-ESA对RL95-2细胞中p53,PPARγ,caspase-3,Bcl-2和Bax蛋白表达的影响
• 3.5 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢