青虾Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制因子和精子明胶酶基因全长cDNA的克隆及表达分析

论文摘要

青虾,学名日本沼虾（Macrobrachium nipponense）,隶属十足目（Decapoda）、长臂虾科（Palaemonidae）、沼虾属（Macrobrachium）、具有营养价值高、生长快、生殖周期短、病害少等特点,是我国重要的淡水经济养殖品种。由于近年来养殖规模的不断扩大,出现了性早熟等种质退化问题,急需遗传改良。开展青虾生殖发育相关机制的研究,对于解决青虾性早熟问题及培育优良品种十分必要。为此,本文以青虾为研究对象,在实验室构建的青虾精巢CDNA文库的基础上,开展了以下两方面的研究：1.采用RACE技术,首次从青虾精巢中克隆得到Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制因子（Kazal-type serine proteinase inhibitor, KSPI）基因的全长cDNA序列。青虾KSPI基因cDNA全长890bp,3’端非编码区（3’UTR）为546bp,5’UTR为80bp,开放阅读框（ORF）为264bp,共编码87个氨基酸。预测蛋白包含1个由22个氨基酸组成的信号肽和1个保守的Kazal型结构域（CIX5CⅡX（6）VCⅢX（5） TYXNXCⅣX6CⅤX122CⅥ）,结构域中P1活性位点为苏氨酸残基。将青虾KSPI与已报道的中国明对虾、斑节对虾、南美白对虾、克氏原螯虾以及罗氏沼虾共14种KSPI氨基酸序列进行系统进化分析,结果表明,青虾KSPI与同样来源于精巢的罗氏沼虾KSPI进化关系最近聚为一支,其他虾类来源于肝胰腺和血细胞的KSPI聚为另外两支。采用定量PCR技术检测KSPI基因在心脏、精巢、卵巢、脑、肝脏及肠中的组织分布情况,结果显示,KSPI基因在肝脏、脑及肠中仅有微量表达,在精巢、心脏和卵巢中有较高表达,其中精巢表达水平极高,并与心脏和卵巢表达差异分别达到显著（P<0.05）和极显著（P<0.01）水平,推测KSPI可能在青虾雄性生殖过程中具有重要作用。2.采用RACE技术,从青虾精巢中克隆得到了青虾精子明胶酶基因（M.nipponense sperm gelatinase,MnSG）的全长cDNA序列。MnSG基因cDNA全长711bp,3’端非编码区（3’UTR）为271bp,5’UTR为56bp,开放阅读框（ORF）为384bp,共编码127个氨基酸,其中包含1个由21个氨基酸组成的信号肽。在NCBI的核酸和蛋白质数据库Blast的搜索结果发现,该基因仅有罗氏沼虾精子明胶酶基因一个同源序列,氨基酸序列同源性达到90%。采用定量PCR技术检测青虾精子明胶酶基因在心脏、精巢、卵巢、脑、肝脏及肠中的组织分布情况,结果显示,该基因在精巢中表达水平极高,在心脏中有较弱的表达,而卵巢、脑、肝脏及肠中均未检测到青虾精子明胶酶基因的表达。定量PCR结果表明,该基因在青虾生殖系统中为雄性特有,由此推测该基因可能在雄性生殖过程中发挥重要作用,具体功能有待进一步研究。本研究结果为青虾Kaza1型丝氨酸蛋白酶抑制因子和精子明胶酶基因的功能研究奠定基础,为青虾生殖相关基因结构和功能研究提供参考,同时也为甲壳类其他物种生殖相关基因的研究提供借鉴。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1 青虾基因研究现状
• 1.1 卵巢发育相关基因
• 1.1.1 卵子成熟调控相关基因
• 1.1.2 卵子和胚胎发育相关基因
• 1.1.3 卵黄蛋白原代谢相关基因
• 1.2 免疫相关基因
• 1.3 蜕皮相关基因
• 1.4 性别相关基因
• 2 蛋白酶抑制因子研究概述
• 2.1 蛋白酶抑制因子的分类及特点
• 2.1.1 丝氨酸蛋白酶抑制因子
• 2.1.2 半胱氨酸蛋白酶抑制因子
• 2.1.3 天门冬氨酸蛋白酶抑制因子
• 2.1.4 金属蛋白酶抑制因子
• 2.2 丝氨酸蛋白酶抑制因子的分类及特点
• 2.2.1 Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制因子
• 2.2.2 Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制因子
• 2.2.3 α-巨球蛋白
• 2.2.4 Serpin型丝氨酸蛋白酶抑制因子
• 2.3 Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制因子研究概述
• 2.3.1 Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制因子结构特点
• 2.3.2 Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制因子抑制机制
• 2.3.3 Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制因子生理功能
• 3 精子明胶酶基因
• 4 研究目的与意义
• 第二章 青虾KAZAL型丝氨酸蛋白酶抑制因子基因的克隆及表达分析
• 1 实验材料
• 1.1 实验虾
• 1.2 试剂
• 1.3 仪器
• 2 实验方法
• 2.1 青虾总RNA的提取
• 2.1.1 实验用品的预处理
• 2.1.2 总RNA的提取
• 2.1.3 总RNA检测
• 2.2 青虾KSPI基因部分片段的获得
• 2.3 青虾KSPI的3'RACE
• 2.3.1 引物的设计
• 2.3.2 反转录
• 2.3.3 3'端扩增
• 2.4 青虾KSPI的5'RACE
• 2.4.1 引物的设计
• 2.4.2 反转录
• 2.4.3 5'端扩增
• 2.5 PCR产物的克隆
• 2.5.1 感受态的制备
• 2.5.2 PCR产物的回收
• 2.5.3 连接
• 2.5.4 转化
• 2.5.5 重组克隆的筛选
• 2.5.6 重组克隆的鉴定
• 2.6 序列的测定及分析
• 2.7 青虾KSPI基因的表达分析
• 2.7.1 引物的设计
• 2.7.2 反转录
• 2.7.3 半定量扩增
• 2.7.4 荧光定量扩增
• 3 结果
• 3.1 青虾KSPI基因3'端的分离
• 3.2 青虾KSPI基因5'端的分离
• 3.3 青虾KSPI基因全长cDNA的获得
• 3.4 生物信息学分析
• 3.5 系统发育分析
• 3.6 青虾KSPI基因在不同组织中的表达分析
• 3.6.1 半定量分析
• 3.6.2 荧光定量分析
• 4 讨论
• 第三章 青虾精子明胶酶（SPERM GELATINASE,SG）基因的克隆及表达分析
• 1 材料
• 2 方法
• 2.1 青虾总RNA的提取
• 2.2 MnSG基因部分片段的获得
• 2.3 MnSG基因的3'RACE
• 2.3.1 引物的设计
• 2.3.2 反转录
• 2.3.3 3'端扩增
• 2.4 青虾MnSG的5’RACE
• 2.4.1 引物的设计
• 2.4.2 反转录
• 2.4.3 5'端扩增
• 2.5 PCR产物的克隆
• 2.6 序列的测定及分析
• 2.7 MnSG基因的表达分析
• 2.7.1 引物的设计
• 2.7.2 反转录
• 2.7.3 半定量扩增
• 2.7.4 荧光定量扩增
• 3 结果
• 3.1 MnSG基因3'端的分离
• 3.2 MnSG基因5'端的分离
• 3.3 MnSG基因全长cDNA的获得
• 3.4 生物信息学分析
• 3.5 MnSG基因在不同组织中的表达分析
• 3.5.1 半定量分析
• 3.5.2 荧光定量分析
• 4 讨论
• 全文结论
• 参考文献
• 附录 实验试剂及配置
• 致谢
• 已发表或已接受的论文