富营养化浅水湖泊太湖中军团菌属的分布及多样性

论文摘要

环境中常见的致病微生物包括病毒、立克次体、支原体、细菌、真菌等。这些致病微生物广泛存在于水体、大气和固体废弃物如生活垃圾当中,是引起传染病的罪魁祸首。全球气候变暖和人类活动加剧了湖泊的富营养化过程,进而可能影响水体中致病微生物的丰度、活性和致病性。目前,致病微生物对于营养盐浓度变化的响应及其机制的研究开展的较少,还主要集中在部分细菌（如霍乱弧菌）。军团菌是一种常见的致病微生物,是肺炎型军团病（Legionnaires’disease）和非肺炎型庞蒂亚克热（Pontiac fever）的病原体。人们通常是由于呼吸了被军团菌污染的水源散发的水雾而传染上军团病的。截止目前,已发现的军团菌有50多个种,其中近一半与人类疾病有关。有关军团菌的研究主要集中在人工供水系统,如冷却塔、污水处理厂、配水系统等,以及对感染军团病病人血清的分析,而对自然环境水体中军团菌的分布和多样性研究以及军团菌与营养盐的关系的研究相对较少。太湖水体富营养化严重,不同湖区存在营养盐浓度梯度,富营养化对饮用水的安全造成威胁。为了解富营养化浅水湖泊中一种致病微生物军团菌的存在情况,我们选定典型浅水湖泊太湖为研究对象。为揭示太湖军团菌种群的组成和多样性,并探讨其与营养水平的关系。我们首先建立了一种快速检测环境水样中军团菌属的方法——巢式PCR方法结合MPN（最大可能数）法。随后,采用该方法分析了太湖不同湖区32个位点中军团菌的分布情况,结合变性梯度凝胶电泳（denatured gradient gel electrophoresis,DGGE）方法探究了两种不同生活状态的军团菌（附着细菌和浮游细菌）在太湖不同湖区的的种群多样性,通过对军团菌种群多样性与环境因子动态变化的多元统计分析,揭示各个湖区中影响军团菌种群结构的主导环境因子,探讨军团菌的分布和多样性与营养盐的关系。最后通过DGGE典型条带切胶测序方法,分析不同湖区中军团菌的主要种类,了解太湖不同湖区存在致病军团菌的风险情况。论文获得的主要结果如下：1.建立了巢式PCR结合MPN检测环境水体中军团菌的方法,采用两对引物扩增环境样品的细菌基因组DNA。将检测到含有军团菌的样品DNA模板进行十倍梯度稀释,由最低检测的稀释度,计算出样品中军团菌的细胞数,同时确定方法检测的灵敏度。并用克隆建库、构建系统树的方法来验证本文研究方法的特异性。研究结果表明,巢式PCR后克隆序列均为军团菌序列,本方法的检测限为2.74fg/μL军团菌DNA。2.运用巢式PCR-MPN法研究军团菌在太湖不同湖区的检出情况,结果显示,除五里湖浮游样品外,军团菌在全湖其他湖区均有分布,其中北部湖区（如梅梁湖、贡湖）、东南部湖区（如南部沿岸区和东部沿岸区）和湖心区的检出率均在20%以上。从2月到11月,军团菌的检出率呈现先上升后下降的趋势,最高检出率出现在8月份的附着细菌样品中,达到75%,最低检出率出现在11月份的浮游细菌样品中,为12.5%。总体而言,军团菌在附着细菌样品中检出率均≥50%,而在浮游细菌样品中检出率≥12.5%。配对t检验显示,2月份和11月份的检出率在两种生活状态的细菌样品中存在显著差异,8月份的检出率存在极显著差异。3.采用DGGE分析阳性样品中军团菌的基因多样性,并计算不同湖区军团菌的DGGE条带数、种群多样性Shannon-weaver指数、优势度Simpson指数和群落均匀度Pielou指数。结果显示,附着细菌样品中贡湖湾和西部沿岸区军团菌多样性最丰富,随着季节的变化,DGGE条带数一直增加,而Shannon-Wiener指数、Simpson指数和Pielou指数先减后增,最小值都出现在2月份或者5月份,最大值出现在8月份或者11月份。而浮游细菌样品中梅梁湾、东太湖和南部沿岸区多样性最丰富,季节变化上,DGGE条带数、Shannon-Wiener指数和Simpson指数都呈现先增后减的趋势,而Pielou指数一直减少,最大值均出现在5月份,最小值均出现在11月份。4.对DGGE典型条带进行切胶回收测序,共获得68个序列,以97%相似度为依据,获得的序列可划分为28个OTUs （Operational Taxonomic Unit,操作分类单位）。构建细菌的16SrRNA基因的系统进化树,获得的序列均属于军团菌目,主要为非培养的Legionella spp.,此外,还存在与致病军团菌种类为Legionella feeleii, Legionella longbeachae, Tatlockia maceachernii和Legionella pneumophila高度相似的序列。5.在DGGE分析军团菌群落结构变化的基础上,采用多元统计学方法研究军团菌群落组成与环境因子的相关性,结果表明太湖的营养水平（TN、TP、浊度等）和浮游藻类总生物量是军团菌种群组成的重要影响因子。因此,太湖军团菌的组成和多样性与营养盐浓度梯度之间有着一定的相关性关系。在营养盐较高的北部湖区（梅梁湖、贡湖）和西南部湖区（西部沿岸区和南部沿岸区）,军团菌的检出率和多样性均较高。分析温度变化与军团菌检出率的关系结果表明,大部分湖区在温度为20℃左右时具有最大的检出率。本研究首次系统的分析了富营养化浅水湖泊太湖军团菌组成、多样性的时空变化特征,以及主导的环境因子。获得的研究结果对于揭示湖泊富营养化与军团菌的分布和多样性的关系具有重要的意义,同时也可以作为评价富营养化湖泊是否存在潜在健康风险的依据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 环境中的致病微生物
• 1.1.1 军团菌简介
• 1.1.2 水体富营养化与环境中的致病微生物
• 1.2 湖泊微生物生态的研究方法
• 1.2.1 湖泊微生物生态的研究方法进展
• 1.2.2 微生物群落研究的主要分子生物学方法
• 1.2.3 本论文采用的分子生物学研究方法
• 1.3 本论文的主要研究内容、技术路线和研究意义
• 1.3.1 本论文的研究内容
• 1.3.2 本论文的技术路线
• 1.3.3 研究意义
• 第2章 巢式PCR-MPN检测法检测环境水体中的军团菌
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 环境样品的采集及处理
• 2.2.2 细菌基因组DNA的提取
• 2.2.3 巢式PCR结合MPN（最大可能数）法扩增
• 2.2.4 验证巢式PCR的特异性
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 巢式PCR结合MPN法检测结果
• 2.3.2 测序结果与GenBank中已知序列对比结果
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 第3章 探究太湖军团菌的分布及多样性
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 样品的采集及处理
• 3.2.2 巢式PCR检测军团菌的分布
• 3.2.3 军团菌属种群结构分析
• 3.2.4 统计分析
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 巢式PCR检测军团菌在全太湖中分布
• 3.3.2 军团菌种群结构及多样性分析
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 第4章 军团菌检出率及种群结构与环境因子的动态相关分析
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 非生物因子分析
• 4.2.2 生物因子分析
• 4.2.3 军团菌在太湖中的检出率与主要环境因子温度之间的关系
• 4.2.4 军团菌种群结构分析
• 4.2.5 多元统计分析
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 非生物因子和生物因子
• 4.3.2 主要环境因子与军团菌检出率的关系
• 4.3.3 主要环境因子与军团菌种群组成的相关分析结果
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 参考文献
• 参与课题与发表论文
• 致谢