论文摘要
背景和目的据UICC World Cancer Congress 2006报道,恶性肿瘤仍然是21世纪严重危害人类生命健康的主要疾病。全球年新发肿瘤病例约1100万,死亡700万,现患病例2500万。以此趋势,至2020年,每年新发病例将达1600万,死亡1000万。目前,我国年发病人数约200万,死亡150万;在城镇居民中,恶性肿瘤仍是死亡的主要原因。研究表明肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor,HGF）异常表达与恶性肿瘤的发生、发展、预后密切相关。HGF作为一种多功能细胞因子,主要经旁分泌（基质细胞）或自分泌（肿瘤细胞）途径产生,通过HGF/Met信号途径,激活受体酪氨酸激酶,使下游的信号分子磷酸化,产生系列的生物学效应,主要表现为丝裂原、能动原、形态发生原效应和促血管新生,促进肿瘤的生长、迁徙和侵袭。对霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤等研究发现HGF与淋巴瘤的发生、发展可能存在相互促进关系:HGF的高分泌促进淋巴瘤的发生、发展,而淋巴瘤细胞的增殖又促进HGF自分泌。还证实HGF水平与淋巴瘤的临床疗效、预后等密切相关,是一个值得进一步研究的指标。因此,阻断HGF/Met系统的信号转导可能成为抗肿瘤治疗的新策略之一。就现研究而言,NK4是理想的HGF/Met信号途径阻断剂,其机制在于能全面拮抗HGF活性。NK4是HGF的一个含447个氨基酸残基的片段,保留了HGF与其受体c-MET的结合部位,能和HGF竞争性结合受体c-MET,但结合后不能使后者发生磷酸化,从而抑制HGF的诱导肿瘤生长、侵袭、迁徙和促血管新生等生物活性。研究证实NK4具二重功能:HGF的抑制剂和非依赖于HGF的血管新生抑制剂,具肿瘤治疗价值。对肺癌、大肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌、肝癌、多发性骨髓瘤、纤维肉瘤等多种恶性肿瘤的研究证实,NK4具有显著的抑瘤效应,是HGF相关研究中的重点之一。但迄今国内外尚无NK4对淋巴瘤抑制作用的相关研究。直接使用NK4蛋白和通过载体介导NK4基因转染后的表达是目前主要的研究方法。后者最为常用,根据导入方式分直接导入和转染后导入两种技术。直接导入法不需转染细胞,可直接进行瘤内或腹腔内注射且可反复加强,但持续表达时间短。转染后导入法需先构建其表达载体,再以适当方法转染细胞,然后进行体内或体外实验,虽操作复杂,但因转染后可获稳定、高效表达,效果更理想。因此,在本研究中我们试图通过NK4基因转染Raji细胞,探索NK4对淋巴瘤的抑制作用。拟综合应用分子生物学、细胞生物学、免疫组化等多项技术,如细胞培养、基因克隆、基因转染、半固体培养、实时FQ-PCR、免疫细胞化学、ELISA等,进行相关工作。方法在第一部分,根据靶序列设计引物,采用RT-PCR,获得NK4、c-MET和HGF的特异性目的片段,分别与载体pGEM-T Easy和pMD19-T Simple构建相应重组质粒,作为定量标准;优化反应条件和组分浓度,分别建立NK4 mRNA、c-MET mRNA和HGF mRNA相应的实时FQ-PCR,并进行方法学评价。在维持底层胶琼脂糖浓度为0.5%的基础上,对上层胶琼脂糖浓度（0.1%～0.5%）和细胞浓度（100个/孔～5000个/孔）进行选择,改良琼脂糖半固体培养体系。根据真核载体pVITRO2 MCS2的酶切位点,设计引物,经RT-PCR获得NK4和HGF全长片段,与载体pMD19-T Simple重组,鉴定确认序列正确后扩大、提纯,酶切后回收目的片段分别与和pVITRO2重组,构建重组真核表达质粒pVITRO2-NK4 Whole和pVITRO2-HGF Whole。在第二部分,重组质粒pVITRO2-NK4 Whole和pVITRO2-HGF Whole以阳离子脂质体法分别转染Raji细胞,经潮霉素B筛选、RT-PCR、ELISA和免疫细胞组化等方法,鉴定转染细胞成功与否;通过绘制生长曲线、观察克隆形成能力和生长特点,评价NK4基因、HGF基因转染对Raji细胞生物性状的影响;采用实时FQ-PCR检测转染细胞c-MET mRNA的表达变化;采用ELISA检测NK4基因、HGF基因转染后的磷酸化c-MET蛋白的变化。综合以上结果评价NK4基因转染对Raji细胞的增殖、迁徙和侵袭的抑制作用。此外,使用10 ng/ml HGF蛋白、100 ng/ml NK4蛋白分别处理NK4转染细胞、HGF转染细胞,通过观察克隆形成能力、生长特点、mRNA表达、磷酸化c-MET蛋白等指标的变化,评价NK4蛋白对Raji细胞的抑制作用和NK4基因转染对HGF蛋白的拮抗作用。结果在第一部分,我们构建了的重组质粒pGEM-T Easy-NK4、pGEM-T Easy-c-MET和pMD19-T Simple-HGF,分别作为NK4 mRNA、c-MET mRNA和HGF mRNA的定量标准。分别设计第二引物对和探针,优化了引物、探针、dNTPs和MgCl2的浓度和反应条件,建立了分别检测NK4 mRNA、c-MET mRNA和HGF mRNA的实时FQ-PCR。经方法学评价试验证实:NK4、c-MET和HGF的mRNA实时FQ-PCR的标准曲线斜率分别为-3.513±0.028、-3.680±0.073、-3.710±0.011,相关系数分别为0.999、0.996、0.998,扩增效率分别达92.6±1.0%、87.6±1.4%、86.0±0.4%;批内、日内、日间变异系数分别为2.1%、4.0%、6.8%,1.9%、3.9%、7.0%,2.5%、3.1%、8.3%;灵敏度分别达2、5、5拷贝/μl。筛选后确定上层胶琼脂糖浓度为0.3%、细胞浓度为1000个/孔,结合0.5%琼脂糖底层胶建立半固体培养体系。经RT-PCR获得全长序列的NK4 cDNA和HGF cDNA,并由此构建了真核表达重组质粒pVITRO2-NK4 Whole和pVITRO2-HGF Whole,经PCR、酶切和测序等证实NK4 cDNA和HGF cDNA成功重组并保持序列完整和正确。在第二部分,重组质粒pVITRO2-NK4 Whole和pVITRO2-HGFWhole分别转染Raji细胞。潮霉素B筛选后的转染细胞经RT-PCR确认存在目的片段,培养液中NK4蛋白、HGF蛋白含量分别为4.14±0.19 ng/ml和5.38±0.31 ng/ml,免疫细胞组化结果呈阳性,提示转染成功,获得转染细胞株。NK4转染细胞和HGF转染细胞达生长曲线峰值的时间分别为5天和3天,与对照组（未转染Raji细胞、空载体pVITRO2转染细胞均为4天）相异;前者形成的细胞团较小、边缘整齐、散在细胞少,而后者的细胞团松散、边缘不整齐、细胞呈扩散性生长;两组的c-MET mRNA分别为5.71±0.29和6.48±0.18,磷酸化c-MET蛋白分别为3.35±0.38 U/ml和4.96±1.18 U/ml ;克隆形成数分别为64.39±4.63/孔和124.61±5.16/孔,与对照组相比,差异显著（P<0.001）,两组间差异也具高度统计学意义（P<0.001）。结果提示,NK4基因转染抑制了Raji细胞的生长,而HGF基因转染促进了其生长。此外,NK4蛋白处理的HGF转染细胞组的克隆形成能力降低（89.78±5.38/孔）、处理后10 min的c-MET mRNA增高（7.67±0.20）、HGF mRNA表达显著增强（9.16±0.14）而磷酸化c-MET蛋白降低（8.97±1.19 U/ml）;HGF蛋白处理的NK4转染细胞组的克隆形成能力明显增加（64.39±4.63/孔）、处理后10 min的c-MET mRNA明显增强（8.10±0.22）、NK4 mRNA（9.73±0.34）和磷酸化c-MET蛋白（65.24±2.04 U/ml）均显著增强,分别与对照组及未处理组的差异均有高度统计学意义（P<0.001）。提示NK4蛋白促进了HGF转染细胞c-MET mRNA、HGF mRNA的应激性表达加强,而抑制了克隆的形成和c-MET蛋白磷酸化; HGF蛋白有助于NK4转染细胞的克隆形成,促进c-MET mRNA、NK4 mRNA的表达和c-MET蛋白的磷酸化。研究结论1.构建了定量标准,分别建立了HGF mRNA、NK4 mRNA和c-MET mRNA相应的实时FQ-PCR。2.建立了适宜的半固体培养体系。3.构建了真核表达重组质粒pVITRO2-NK4 Whole和pVITRO2-HGF Whole。4.成功转染Raji细胞,获得NK4基因转染细胞株和HGF基因转染细胞株。5. NK4基因转染对Raji细胞具抑制作用,而HGF基因转染则具促进作用。6. NK4蛋白抑制HGF基因转染细胞的生长,而NK4基因转染细胞对HGF蛋白具拮抗作用。