根癌农杆菌介导的柑橘转化体系优化与转LFY、AP1基因植株的培育

论文摘要

柑橘是世界上最重要的常绿果树之一，其种植面积和总产量均居水果之首。长期以来，运用传统的育种手段进行柑橘遗传改良受到珠心胚干扰、性器官败育、育种周期长以及遗传上高度杂合等因素的影响，导致育种进程缓慢。转基因技术自1983年应用到植物育种以来，发展迅猛，已经成为基因功能鉴定不可缺少的手段，也是实现植物目标性状改良的一种快速和直接的途径。植物童期长短受开花基因调控，将开花调节基因转入植物有望改变童期。本研究以拟南芥花分生组织特异基因LEAFY（LFY）、APETALA1（AP1）为目标基因，以胚性愈伤组织和实生苗上胚轴分别为外植体，通过根癌农杆菌介导法进行柑橘遗传转化研究，采用GUS组织化学染色和PCR、Southern blotting等技术对转基因材料进行鉴定，采用real-time PCR技术进行基因表达分析；对不同基因型愈伤组织转化率存在差异的原因进行了探讨：对API、LFY基因与内源开花相关基因间的互作进行了分析，并对APl促进早花的机理进行初步研究；主要结果如下：1．柑橘基因型、愈伤组织褐化影响转化率。对15种不同基因型柑橘胚性愈伤组织的转化特性进行研究的结果表明，a)在筛选过程中，抗性愈伤组织多从褐化组织中再生；b)不同基因型愈伤组织褐化程度不同，其中宽皮橘类及其杂种类基因型愈伤组织的褐化最为严重，山金柑和葡萄柚次之，澳洲指橘和伏令夏橙与金柑体细胞杂种的愈伤组织不褐化，甜橙类愈伤组织的褐化表现为褐化、轻微褐化和不褐化；c)褐化严重的柑橘基因型转化率较高，而不褐化类型转化率较低，表明愈伤组织的褐化程度与转化率有关：d)愈伤组织的褐化与其本身的总多酚含量有关，总多酚含量高的易表现褐化，而总多酚含量受基因型的影响。综上所述，推测在根癌农杆菌介导的柑橘胚性愈伤组织的遗传转化中，基因型通过愈伤组织的褐化间接影响转化率。而柑橘愈伤组织转化pBIN-mGFP5的GFP瞬时表达结果，表明总多酚含量高的宽皮橘类及其杂种类基因型的转化率显著高于总多酚含量低的柑橘基因型，与前面结果相一致。2．在前人研究基础上，进一步优化了柑橘愈伤组织转化再生体系，建立了5步筛选再生法。基于该体系，获得19种基因型的转基因细胞系245个，其中6种基因型再生，获得120个转基因芽系，有34个转基因株系移栽成活，主要表现在，1)冰糖橙胚性愈伤组织转化：a)获得转AP1基因的转化细胞系7个，胚状体再生率高达88％：再生芽经GUS染色、PCR分析鉴定为阳性，Southern杂交结果表明所检测的4个转化细胞系中AP1基因均以单拷贝插入；再生芽生根困难，通过试管嫁接获得了完整植株，但嫁接苗在生长后期表现落叶、芽枯、死亡：b)获得转LFY基因的转化细胞系2个，其中一个获得再生植株，经GUS染色、PCR分析鉴定为阳性，Southern杂交结果表明LFY基因以3个拷贝插入；再生植株初期生长健壮，移栽后表现株形矮小，分枝多，叶片小，整株成丛状。以上结果表明AP1、LFY对植株生长有较大影响。2)椪柑胚性愈伤组织转化：a)获得转LFY基因的转化细胞系9个，其中4个细胞系获得再生植株，有3个细胞系经PCR检测为阳性，Southern杂交结果表明外源基因以单拷贝插入；b)获得转AP1基因的转化细胞系113个，其中再生细胞系61个，移栽植株104棵，源自29个株系；移栽株系经GUS染色、PCR分析，表明有93％为阳性，经Southern杂交表明外源基因以1-2个拷贝插入；转基因植株腋生组织生长旺盛，多有2-4个分枝／株，与未转化对照形态差异较大；real-time RT-PCR结果表明AP1基因在芽中表达量最高，其次是根，而在愈伤组织与胚状体中表达量较低，内源开花基因CiAP1、CiLFY、CiFT、CiTFL受APl基因影响发生上调或下调表达。3)其他基因型愈伤组织转AP1基因获得转化植株的有，伏令夏橙、Succari甜橙、改良橙与尾张杂种、茶枝柑。3．以实生苗上胚轴为试材进行转化，获得3种基因型的GUS阳性株系42个，其中21个株系移栽成活，18个株系经PCR鉴定为阳性。一株转AP1基因的金柑表现早花性状。Real-time RT-PCR结果表明转基因（LFY、AP1）对内源开花相关基因的表达有较大影响。以上结果主要表现在，1)金柑实生苗上胚轴转化AP1基因：从1021个外植体中获得GUS阳性芽19个，平均转化率为1.86％；从移栽的8株GUS阳性植株中，有6株经PCR鉴定为阳性，其中3株（J3、J10、J17）进行了Southern杂交鉴定，表明外源基因以1-5个拷贝插入。转基因植株生长正常，但平均分枝数／株大于未转化对照。转基因植株（J3）在移栽11个月后开花，而正常植株需3年左右才可开花，表明金柑中异位表达AP1基因可以促进早花。Real-time RT-PCR结果表明AP1基因表达量与其插入的拷贝数成正相关，而与开花早晚无关；AP1基因通过促进CiLFY与CiFT的表达，抑制CiTFL的表达促进开花。2)冰糖橙上胚轴切段转化LFY基因：最终转化率为8.88％；获得1株转AP1基因和12株转LFY基因的GUS阳性植株；转化植株生长正常，与未转化对照无明显差异；PCR分析表明，除一株转化LFY基因的植株为阴性外，其余均为阳性：转LFY基因植株（B1）经Southern杂交鉴定，表明外源基因以单拷贝形式插入；real-time RT-PCR结果表明LFY基因在不同转基因株系中表达量不同，根中表达量略低于芽；内源开花基因CiAP1、CiLFY、CiFT在不同转化株系中分别表现上调或下调表达，CiTFL在所有转化株系中均表现下调表达，表明LFY基因影响内源开花相关基因的表达。3)山金柑转化AP1基因：从50个外植体中获得8个抗性芽，其中3个经GUS染色鉴定为转化子，但再生芽弱小，未能获得植株。4．本文还对如何提高根癌农杆菌介导的柑橘转化效率，T-DNA插入整合的拷贝数，转基因植株群体建立的必要性，以及开花基因在植物童期控制方面的应用潜力进行了探讨。

论文目录

• 缩略词表
• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 问题的提出
• 1.2 前人研究进展
• 1.2.1 柑橘遗传转化的研究进展
• 1.2.1.1 转入基因的类型
• 1.2.1.2 转基因的方法
• 1.2.1.3 所用的外植体类型
• 1.2.1.4 使用的菌株类型
• 1.2.1.5 筛选剂的应用
• 1.2.1.6 报告基因的应用
• 1.2.1.7 培养条件
• 1.2.1.8 转基因植株的鉴定方法
• 1.2.2 开花调节基因及其研究进展
• 1.2.2.1 植物开花途径及相关基因
• 1.2.2.2 花分生组织特异基因
• 1.2.2.3 花序分生组织特异基因
• 1.2.2.4 开花整合基因
• 1.3 本研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 转化受体材料
• 2.1.2 供试农杆菌菌株和质粒
• 2.1.3 转化实验所用培养基配方
• 2.1.4 主要的生化试剂:
• 2.2 方法
• 2.2.1 柑橘愈伤组织总多酚和PPO粗提液的提取
• 2.2.1.1 总酚提取
• 2.2.1.2 多酚氧化酶（PPO）酶液制备
• 2.2.2 实生苗上胚轴切段再生实验
• 2.2.2.1 不同激素组合与提取物对冰糖橙再生芽的影响
• 2.2.2.2 不同切割方式对冰糖橙再生芽的影响
• 2.2.2.3 不同柑橘上胚轴再生试验
• 2.2.3 柑橘外植体材料对Km的敏感性试验
• 2.2.3.1 胚性愈伤组织对Km的敏感性试验
• 2.2.3.2 上胚轴切段对Km的敏感性试验
• 2.2.4 柑橘胚性愈伤组织对Cef的敏感性试验
• 2.2.5 农杆菌EHA105菌株增殖曲线的测定
• 2.2.6 根癌农杆菌介导的柑橘遗传转化
• 2.2.6.1 柑橘外植体材料的准备
• 2.2.6.2 农杆菌侵染液的制备
• 2.2.6.3 侵染
• 2.2.6.4 共培养
• 2.2.6.5 不同共培养温度对转化率的影响
• 2.2.6.6 TDZ在愈伤组织转化中的作用
• 2.2.6.7 筛选培养、再生
• 2.2.6.8 冰糖橙转AP1基因再生芽的培养
• 2.2.6.9 嫁接及移栽
• 2.2.7 GUS染色-组织化学分析
• 2.2.8 GFP荧光检测
• 2.2.9 PCR检测
• 2.2.9.1 引物设计
• 2.2.9.2 PCR反应体系及扩增程序
• 2.2.9.3 DNA提取
• 2.2.10 Southern blotting检测
• 2.2.11 RNA提取及cDNA第一链的合成
• 2.2.11.1 植物总RNA提取
• 2.2.11.2 总RNA的浓度及琼脂糖凝胶检测
• 2.2.11.3 第一链cDNA的合成
• 2.2.12 目的基因在植物细胞不同发育时期的表达谱分析
• 2.2.13 转基因植株和未转化植株形态比较
• 3 结果与分析
• 3.1 柑橘实生苗上胚轴切段的再生
• 3.1.1 不同培养基配方对再生芽的影响
• 3.1.2 不同切割方式对再生芽的影响
• 3.1.3 其他柑橘基因型上胚轴再生能力的测试
• 3.2 受体材料对抗生素的敏感实验
• 3.2.1 柑橘胚性愈伤组织对卡那霉素（Km）的敏感性试验
• 3.2.2 柑橘胚性愈伤组织对头孢霉素（Cef）的敏感性试验
• 3.2.3 柑橘上胚轴切段对卡那霉素（Km）的敏感性试验
• 3.3 农杆菌EHA105菌株增殖曲线的测定
• 3.4 柑橘愈伤组织遗传转化条件的优化
• 3.4.1 侵染时离心对转化的影响
• 3.4.2 不同共培养温度对转化的影响
• 3.4.3 TDZ在愈伤组织转化中的作用
• 3.4.3.1 TDZ对愈伤组织生长的影响
• 3.4.3.2 共培养培养基中附加TDZ对转化率的影响
• 3.4.3.3 筛选培养基中附加TDZ对转化的影响
• 3.5 柑橘胚性愈伤组织转化
• 3.5.1 不同基因型柑橘愈伤组织转化特性的研究
• 3.5.1.1 转化子的生长—褐化与再生
• 3.5.1.2 基因型及愈伤组织的褐化对转化率的影响
• 3.5.1.3 柑橘胚性愈伤组织保存年限对转化的影响
• 3.5.1.4 胚性愈伤组织体胚发生能力对转化的影响
• 3.5.1.5 不同柑橘胚性愈伤组织转化GFP的瞬时表达
• 3.5.2 转基因冰糖橙愈伤组织的再生与鉴定
• 3.5.2.1 转AP1基因植株再生与鉴定
• 3.5.2.2 转化LFY基因的植株再生与鉴定
• 3.5.3 转基因椪柑胚性愈伤组织的再生及鉴定
• 3.5.3.1 转AP1基因植株的再生与鉴定
• 3.5.3.2 椪柑转LFY基因的植株再生与鉴定
• 3.5.4 茶枝柑转化AP1基因的植株再生及鉴定
• 3.5.4.1 胚状体的诱导及发育
• 3.5.4.2 转化子的GUS组织化学染色分析
• 3.5.4.3 转基因植株的再生及PCR鉴定
• 3.5.4.4 转基因植株的Southern blotting检测
• 3.5.5 改良橙与尾张杂种转AP1基因的植株再生及PCR鉴定
• 3.5.6 Succari甜橙转AP1基因的植株再生
• 3.5.7 南丰蜜橘转AP1基因抗性材料的获得及鉴定
• 3.5.7.1 转化子的GUS组织化学染色
• 3.5.7.2 转基因植株PCR鉴定
• 3.5.7.3 Southern blotting检测结果
• 3.6 柑橘实生苗上胚轴切段转基因研究
• 3.6.1 实生苗上胚轴转基因的概况
• 3.6.2 金柑转AP1基因植株的再生与鉴定
• 3.6.2.1 金柑上胚轴转化特性的研究
• 3.6.2.2 GUS染色揭示高频率的嵌合体再生
• 3.6.2.3 金柑上胚轴切段转基因植株的再生
• 3.6.2.4 转基因植株的PCR鉴定
• 3.6.2.5 转基因植株的Southern blotting分析
• 3.6.2.6 转基因植株的形态特征与生长状况
• 3.6.2.7 外源AP1基因及内源开花相关基因的表达分析
• 3.6.3 冰糖橙实生苗上胚轴切段转LFY基因植株的再生与鉴定
• 3.6.3.1 冰糖橙转基因植株的再生
• 3.6.3.2 转化子的GUS组织化学染色
• 3.6.3.3 转基因植株的PCR检测
• 3.6.3.4 转基因植株的Southern blotting分析
• 3.6.3.5 外源LFY基因与内源开花相关基因的表达分析
• 3.6.4 山金柑转AP1基因芽的再生与鉴定
• 3.6.4.1 转基因再生芽的生长
• 3.6.4.2 转基因芽的GUS组织化学染色
• 4 讨论
• 4.1 提高根癌农杆菌介导柑橘遗传转化率的方法
• 4.1.1 选择容易转化的柑橘种类（基因型）对转化至关重要
• 4.1.2 选择合适的外植体类型是转化成功的保证
• 4.1.3 采用最佳的培养再生方式对获得转基因植株有重要影响
• 4.2 转基因群体构建的必要性
• 4.3 LFY、AP1基因对内源开花相关基因表达的影响
• 4.4 开花基因在果树童期控制中的应用前景
• 参考文献
• 致谢
• 在读期间发表及待发表的论文题录