论文摘要
第一部分YAP1基因与PCOS的关联性分析研究背景：多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome, PCOS）是一个高度复杂和异质性的女性内分泌疾病。其主要的临床表现为月经不规律,高雄激素表现以及卵巢多囊性改变。除影响患者生育健康外,PCOS患者也经常合并肥胖,胰岛素抵抗等代谢异常。随年龄增长,PCOS远期并发症如2型糖尿病,心血管疾病,子宫内膜癌和卵巢癌等的发生率较非一般人群明显上升。在前期进行的GWAS中,我们验证的P值在10E-6范围内的位点,发现了3个可能的致病区域。PCOS的GWAS结果需要在不同人群进一步分析验证,同时P值在10E-5左右的位点可能也是PCOS的易感位点,也需要扩大样本量以进一步分析。Yes相关蛋白1（YAP1:yeast-associated protein1）是一重要的转录辅助因子。YAP1作为Hippo信号通路的关键下游蛋白,其受Hippo信号通路的调控,从而在器官大小的调控和肿瘤的发生中起重要作用。在哺乳动物中,YAP1其功能域相对保守,并在组织和器官中广泛表达。因此,对前期的GWAS的全部位点资料回顾分析后,我们选择了位于YAP1的位点,扩大样本量行进一步分析。研究目的：验证YAP1与PCOS的关联性。经过病例对照关联性分析发现YAP1为PCOS易感基因后,继续进行家系研究可以在一定程度上剔除环境因素对关联性的可能影响,从而进一步验证候选基因。研究方法：本部分研究共分两步。第一步为病例对照研究,共有2252名中国汉族人群被纳入此研究。其中,PCOS患者1115例,对照标本共1137例。所有受试者均来自于山东大学附属省立医院生殖医学研究中心。选择了位于YAP1的3个有代表性的位点rs11225138、rs11225161、rs11225166采用taqman-MGB探针行SNP分型后,与GWAS资料进行meta分析。第二步验证YAP1在PCOS家系中是否存在危险等位基因的过度传递。我们收集了276例无血缘关系的确诊为PCOS为先证者,采用由其父亲,母亲以及本人组成的核心家系进行家系研究。采用taqman-MGB探针行SNP分型研究YAP1上SNP位点rs11225138、rs11225161后,继续进行传递不平衡分析（TDT）。结果：在第一步的病例对照研究中,1)验证研究中rs11225161的次级等位基因A在PCOS组明显高于对照组（P=1.4E-4,OR=1.32）,经过合并GWAS数据进行meta分析后其差异显著性（P=3.98E-09,OR=1.39）达到GWAS标准,且经过校正BMI和年龄后仍有统计学差异（P=1.53E-04）。2)位点rs11225138的次级等位基因G在PCOS组明显高于对照组（P=6.2E-3,OR=1.21）,经过合并GWAS数据进行meta分析后其差异显著性（P=1.16E-04,OR=1.22）未达到GWAS标准,但经过校正BMI和年龄后无统计学差异（P=0.09）。3)rs11225166在PCOS组和对照组无明显区别（P=0.18）,但是经合并计算后得到阳性结果（P=0.0026）。在第二步的家系研究中,rs11225138和rs11225161均的基因型分布符合哈迪-温伯格平衡；进行TDT后,位点rs11225138危险等位基因G存在过度传递现象并有统计学意义（Transmitted:NOT-Transmitted=52:119,χ2=26.25, P=2.99E-07）; SNP rs11225161等位基因G也在存在过度传递现象（Transmitted:NOT-Transmitted=40:100,χ2=25.71, P=3.96E-07）。排除母亲既往月经不规律的家系后,结果与之前无差异。结论：1)我们通过扩大样本首次验证了rs11225161和rs11225138是与PCOS明显相关的位点,YAP1是PCOS易感基因。2)在PCOS的核心家系中,存在位点rs11225161和rs11225138的传递不平衡现象,进一步提示YAP1是可以在PCOS核心家系中传递的易感基因。第二部分多囊卵巢综合征YAP1易感位点与IVF/ICSI促排卵结局研究研究背景：多数多囊卵巢综合征综合征患者面临的生育问题可以在经过控制体重或者克罗米芬促排卵后获得成功妊娠,但是仍有部分人群需要行辅助生殖治疗。在需进行辅助生育治疗的PCOS中,其多表现对促性腺激素（Gn）的较高反应性即较低Gn使用剂量以及高获卵率。而这种卵巢刺激的反应性可能与PCOS发病的机制相关。研究目的：为进一步解释卵巢反应性以及YAP1在PCOS中的发病机制,我们分别在对照和病例中研究经过GWAS确定的PCOS易感基因YAP1上位点rs1894116的基因型与促排卵结局关联性,以及易感位点rs1894116与妊娠结局的关系。研究方法：回顾性分析来自于因不孕在2009年6月2011年12月于山东大学附属省立医院生殖医学研究中心,采用长方案进行IVF/ICSI治疗的患者。其中PCOS共440例,而对照共2254例。观察在不同的rs1894116基因型下促排卵结局以及妊娠结局的关联。结果：1)在PCOS中,Gn的起始剂量（153.37±40.29IU）,Gn使用天数以及Gn使用总量（1945.81±870.37IU）均明显低于对照组,而取卵数（14.6±6.3）和卵裂数（10.7±5.9）明显高于对照组,但是两组之间妊娠率以及流产率无明显区别。2)应用rs1894116显性模型比较PCOS组内的促排卵结局的差别,危险等位基因组（AA+AT）与保护性等位基因组（TT）间Gn的起始剂量以及Gn使用总量间无明显差别；而且两组间取卵率以及卵裂数也无统计学差异；但是危险等位基因组在HCG日E2（6073.85±2986.91）明显高于保护性等位基因组（5364.72±2766.58）。3)在对照组中应用显性模型进行比较,结果与PCOS组中相似。危险等位基因组在HCG日E2（3829.52±2357.78）明显高于保护性等位基因组（3641.75±2355.11）,而且基础内分泌E2两组之前也有明显差别（41.10±17.21vs.39.10±15.95）。4)进一步分析新生儿体重时,危险等位基因组母亲的新生儿体重高于保护性等位基因组（3.48±0.66kg vs.3.31±0.79,P=0.03）结论：位于YAP1上的PCOS易感位点RS1894116不能反映进行促排卵治疗中Gn的使用剂量差别和卵巢对Gn的反应,但是位点RS1894116可以一定程度上反应卵巢的E2分泌情况。而且拥有rs1894116危险等位基因的母亲其新生儿体重相对较高。第三部分PCOS患者中YAP1全外显子突变筛查以及YAP1在卵巢中的初步定位研究背景：在前期的研究中,经过经验证GWAS结果后发现的PCOS的易感基因YAP1,在第二期GWAS中得到了进一步的验证。但是,通过前期全基因组关联性分析以及后续验证确定的易感基因需要进行功能性研究以明确其在PCOS致病机制中的作用。在进行功能研究之前,需要对YAP1进行初步的外显子筛查分析以及卵巢的定位作为基础研究分析。研究目的：为进一步明确YAP1在PCOS中的发病作用,需在PCOS患者中对YAP1行全外显子以及非翻译区（UTR）的突变检测；同时需要在卵巢上对YAP1行定位研究以确定其在目的器官上表达。研究方法：1)选取PCOS患者共192例使用普通PCR扩增后直接测序的方法行YAP1全外显子以及UTR区测序。2)使用2周龄,8周龄以及4月龄雌性昆明小白鼠各4只,取其卵巢进行冰冻切片后,使用免疫组织化学的方法定位YAP1在卵巢上的表达。3)行IVF/ICSI治疗的不孕患者经穿刺取卵后的卵泡液,其中诊断为PCOS的共20份,与之相匹配的对照共14份。提取颗粒细胞后比较（?）nRNA水平检验YAP1在颗粒细胞中的表达。结果：1)进行YAP1突变研究的192例PCOS中未检测到未知突变。2)2周龄,8周龄以及4月龄小鼠中均可见颗粒细胞的YAP1染色,但是卵母细胞YAP1染色仅见于2周龄小鼠中。黄体颗粒细胞中YAP1染色较卵丘颗粒细胞浅。3)凝胶电泳可见YAP1目的条带,但是比较颗粒细胞表达时,见对照中YAP1mRNA表达较PCOS高,但是两组之间无统计学意义。结论：YAP1外显子的DNA序列的突变或缺失未发现对PCOS的发病起作用。YAP1在小鼠卵泡颗粒细胞中表达,而且可能存在表达的时象性。人颗粒细胞中也可检测到YAP1的mRNA表达。第四部分YAP1的外周血甲基化以及mRNA表达水平研究研究背景：PCOS是由环境因素和遗传背景共同作用的疾病,而对PCOS进行的动物模型实验研究提示其为一胎源性疾病。胎儿发育时,其表观遗传特点如基因印记丢失或者DNA甲基化在母体环境影响持续地影响下发生改变；而且在分娩后,胎儿的表观遗传会受环境和营养饮食的共同影响。表观遗传的改变不仅仅从一定程度上反映环境因素对基因的作用,而且其本身也可以调控目的基因的表达研究目的：在外周血水平,对PCOS进行YAP1进行甲基化的研究,从表观调控水平解释YAP1在PCOS发病机制的作用。同时比较PCOS和对照外周血中YAP1mRNA表达情况。研究方法：1)选择年龄和BMI一一对应的PCOS以及对照各15例,提取DNA。后进行重亚硫酸盐转化,转化后的DNA经过扩增并切胶纯化后与质粒连接并转染入载体培养,并获得单克隆。进行单克隆的培养并提取质粒,测序目的片段产物并验证甲基化的程度。2)选择新鲜PCOS（?）口对照标本各30例以提取总RNA进行real-time PCR检验外周血的YAP] mRNA表达水平。结果：1)在PCOS和对照中,YAP1均呈现明显的去甲基化状态。但是对照的甲基化率（1.4%）高于PCOS （0.7%）,且有统计学意义（P=0.043）。2)YAP1mRNA表达在对照中较PCOS高,但是两组之间无统计学意义。结论：外周血中YAP1主要呈去甲基化状态。PCOS外周血YAP1甲基化率较对照组低,也是PCOS的一个特征。