副猪嗜血杆菌感染和应激相关基因的鉴定与功能研究

论文摘要

副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis,HPS）是猪的一种呼吸道共栖菌,在特定条件下可侵入机体而引起严重的全身性疾病,被称为副猪嗜血杆菌病或革拉泽氏病（Gl（a|¨）ser’s disease）。该病以多发性浆膜炎、关节炎、脑膜炎和肺炎为主要特征,已经成为影响全球养猪业最为严重的细菌性传染病之一。作为一种新发传染病的病原,人们对其毒力相关因子和致病机理知之甚少,严重制约了诊断与防治技术的研究。病原菌在感染过程中,必须适应动物机体内温度、pH、渗透压、氧和营养物质供应等环境应激的变化,并产生相应的应答反应,因此,广义的毒力相关因子应该包括那些与体内、外环境应答有关的所有病原因子。这些感染相关因子的鉴定与表达调控的研究,不仅有利于病原菌致病机理的解析,而且对疫苗、药物和诊断试剂的设计与研制具有重要的指导意义。本研究运用转录序列选择性捕获（Selective Captureof Transcribed Sequences,SCOTS）技术分别鉴定了HPS在感染猪肺组织中、体外缺铁和高温条件下表达上调的基因共113个,并对其中部分基因编码的蛋白质的免疫原性及与宿主脑组织的相互作用进行了研究,现将主要研究的结果报告如下:1.副猪嗜血杆菌感染和应激相关基因的筛选副猪嗜血杆菌在猪肺组织中上调表达基因的鉴定与功能分析:应用SCOTS技术共鉴定到HPS 0165株在感染猪肺组织中上调表达的基因38个,这些基因按照功能可以分为以下5类:细胞表面蛋白3个、代谢和应激相关蛋白24个、调节蛋白3个、转运蛋白4个、和未知功能蛋白4个。实时荧光定量RT-PCR（qRT-PCR）分析进一步验证了SCOTS结果的可靠性,同时发现黏附素YadA和唾液酸合成酶SiaB两种重要的毒力因子在HPS感染猪的多数组织中均表达。其中YadA在感染猪肺组织中表达量最高,提示它与HPS在猪肺脏的定植有关;而SiaB在感染猪脑组织中表达量最高,可能直接或者间接参与HPS突破血脑屏障和脑膜炎的发生。此外,运用反向Southern Dot Blot技术进一步研究了上述38个HPS体内表达基因与缺铁、厌氧和高温应激之间的关系,为其表达调控及功能的深入研究奠定了基础。副猪嗜血杆菌缺铁应激基因的鉴定:运用SCOTS技术鉴定了HPS在铁限制条件下上调表达的基因36个,分别编码细胞表面蛋白、转运蛋白和结合蛋白、与物质代谢和能量代谢相关的酶或蛋白质。为了验证SCOTS的结果,利用实时荧光定量qRT-PCR技术有6个基因被选作转录水平分析验证。其中recN和hrpA同DNA复制与修复相关,ccmA和acrB同呼吸和电子传递链相关,而ptnC和gmhA同糖代谢相关。结果显示:副猪嗜血杆菌在铁限制条件下上调表达了所有这6个基因高于33倍于正常培养条件。副猪嗜血杆菌在高温条件下上调表达基因的鉴定:应用SCOTS技术筛选到副猪嗜血杆菌在高温条件下上调表达的基因39个,并对所筛选出的基因进行功能注释与分类。这39个基因可以按功能上分为7类:DNA代谢,能量代谢,糖代谢,氨基酸和蛋白质的合成,脂肪酸代谢,转运,调节蛋白和未知功能。通过SCOTS技术在高温条件下筛选出来的HPS上调表达的基因许多都是由转录调节因子。σ32调控的产物。2.副猪嗜血杆菌感染和应激相关蛋白质的免疫原性研究本研究从SCOTS技术筛选获取得到的感染与应激相关的基因中,依次通过生物信息学功能预测,信号肽预测,流式细胞术以及间接免疫荧光检测候选抗原蛋白与猪肺上皮细胞（St.Jude porcine lung cells,SJPLC）的互作与黏附,最终选用了5个候选抗原蛋白,这些抗原的基因在副猪嗜血杆菌的其他血清型中遗传保守,有望能提供交叉保护作用。通过动物保护力实验,从中成功得筛选到一个较好的免疫保护性抗原四型菌毛PilA。在PilA重组蛋白对仔猪免疫保护试验中,从攻毒后死亡率,心脏、肺脏和腹腔的纤维素化病变情况看,PilA的重组蛋白免疫组与全菌灭活苗组免疫保护的效果几乎相同,表明重组蛋白苗及全菌灭活苗免疫均具有一定的免疫保护效果,可以作为新型疫苗的有效成分,并将为研究HPS的致病机理提供新的思路。3.副猪嗜血杆菌感染和应激相关蛋白质与宿主蛋白质的相互作用研究运用酵母双杂交技术从猪脑组织cDNA文库中筛选到与副猪嗜血杆菌毒力因子PilA、AcrB、SiaB相互作用的蛋白质E2A、AP-3和ClqA。筛选前诱饵质粒进行了自激活检测,筛选后又进行了回转实验验证,同时通过pull-down体外验证证实这三对的确能相互结合,降低了假阳性发生率,该结果为副猪嗜血杆菌突破血脑屏障的分子机制的研究奠定了基础。

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摘要

Abstract

缩略语表（Abbreviation）

第1章文献综述

1.1 副猪嗜血杆菌病

1.1.1 病原学

1.1.2 血清与基因型

1.1.3 临床症状

1.1.4 病理变化

1.1.5 致病机理及毒力因子

1.1.6 免疫与疫苗

1.2 SCOTS技术概述

1.2.1 多种差异显示技术的比较

1.2.2 SCOTS技术原理

1.2.3 SCOTS技术的应用

1.2.4 SCOTS技术的优缺点

1.3 反向疫苗学研究

1.4 酵母双杂交技术

1.4.1 酵母双杂交系统的原理

1.4.2 酵母双杂交系统的应用

1.4.3 酵母双杂交系统的优缺点

第2章副猪嗜血杆菌感染和应激相关基因的筛选

2.1 前言

2.2 材料与方法

2.2.1 主要试剂和仪器

2.2.2 培养基,抗生素及铁离子螯合剂的配制

2.2.3 主要缓冲液

2.2.4 菌株、质粒及引物

2.2.5 缺铁、高温及正常体外培养条件

2.2.6 细菌计数

2.2.7 实验动物的分组与感染

2.2.8 菌株的分离和鉴定

2.2.9 rDNA基因的克隆

2.2.10 基因组DNA的制备

2.2.11 基因组DNA和rDNA基因克隆质粒的超声波处理

2.2.12 基因组DNA的光敏生物素酰化

2.2.13 RNA提取及双链cDNA的合成及扩增

2.2.14 cDNA的SCOTS标准化

2.2.15 cDNA的SCOTS富集

2.2.16 SCOTS文库的克隆

2.2.17 反向Southern斑点杂交技术筛选阳性克隆

2.2.18 测序检测生物信息学分析,对筛选到的基因进行功能注释

2.2.19 荧光定量RT-PCR

2.3 结果与分析

2.3.1 副猪嗜血杆菌rDNA重组载体的验证

2.3.2 副猪嗜血杆菌肺组织感染相关的基因

2.3 3 副猪嗜血杆菌铁应激相关的基因

2.3.4 副猪嗜血杆菌高温应激相关的基因

2.4 讨论

2.4.1 副猪嗜血杆菌肺组织感染相关的基因

2.4.2 副猪嗜血杆菌铁应激相关的基因

2.4.3 副猪嗜血杆菌高温应激相关的基因

第3章副猪嗜血杆菌感染和应激相关蛋白的免疫原性的研究

3.1 前言

3.2 材料和方法

3.2.1 主要试剂

3.2.2 主要缓冲液

3.2.3 预测候选抗原蛋白的信号肽

3.2.4 菌株和培养条件,血清,质粒和引物

3.2.5 实验动物

3.2.6 候选抗原基因在不同血清型的菌株中的分布

3.2.7 候选抗原基因的克隆表达以及纯化

3.2.8 SDS-PAGE电泳与Western blot

3.2.9 流式细胞术分析蛋白的表面分布

3.2.10 免疫保护性抗原对细胞的粘附作用

3.2.11 动物实验

3.3 结果与分析

3.3.1 免疫原性蛋白的基因在其它各类血清型中的分布情况检测

3.3.2 免疫原性蛋白的重组表达纯化

3.3.3 流式细胞术分析蛋白的表面分布

3.3.4 免疫保护性抗原对细胞的粘附作用

3.3.5 仔猪抗体水平评价

3.3.6 蛋白对仔猪免疫效力实验

3.4 讨论

3.4.1 抗原蛋白特性分析

3.4.2 保护性抗原的筛选鉴定

第4章副猪嗜血杆菌感染和应激相关蛋白与宿主蛋白质的相互作用

4.1 前言

4.2 材料

4.2.1 菌株,质粒,引物及文库

4.2.2 主要分子生物学试剂

4.3 方法

4.3.1 重组载体的构建

4.3.2 酵母菌的高效转化

4.3.3 检测诱饵质粒的自激活

4.3.4 Mating筛选阳性克隆

4.3.5 β-半乳糖苷酶检测lacZ报告基因的表达

4.3.6 阳性酵母菌落所含质粒的提取

4.3.7 Prey质粒的分离

4.3.8 阳性酵母菌落的回转实验验证

4.3.9 生物信息学分析方法

4.3.10 诱饵蛋白的原核表达载体的构建

4.3.11 候选阳性克隆的原核表达载体的构建

4.3.12 蛋白质表达纯化以及SDS-PAGE和Western blot验证

4.3.13 Pull-down体外验证实验

4.3.14 诱饵蛋白的真核表达载体的构建

4.3.15 质粒转染（脂质体介导转染法）

4.3.16 CFDA-SE细胞增殖与示踪检测试剂盒的检测

4.4 结果与分析

4.4.1 诱饵重组载体的构建和鉴定

4.4.2 诱饵蛋白功能域预测

4.4.3 诱饵质粒自激活的验证

4.4.4 测序和BLAST分析

4.4.5 阳性酵母菌落的回转实验验证

4.4.6 Prey蛋白功能域预测

4.4.7 诱饵蛋白原核重组载体的构建和鉴定

4.4.8 Prey蛋白原核重组载体的构建和鉴定

4.4.9 蛋白质表达纯化以及SDS-PAGE和Western blot验证

4.4.10 PilA,ArcB和SiaB蛋白与宿主蛋白作用方式的预测

4.4.11 Pull-down体外验证实验

4.4.12 诱饵蛋白真核重组载体的构建和鉴定

4.4.13 CFDA-SE细胞增殖与示踪检测试剂盒的检测

4.5 讨论

4.5.1 酵母双杂交技术筛选副猪嗜血杆菌与宿主发生互作的蛋白

4.5.2 PilA,ArcB和SiaB与致病性的关系

4.5.3 酵母双杂交系统的假阳性

4.5.4 Pull-down体外验证实验

4.5.5 PilA与宿主细胞增殖的关系

4.5.6 ArcB与副猪嗜血杆菌与宿主免疫逃避的关系

4.5.7 SiaB与副猪嗜血杆菌与宿主免疫逃避的关系

结论与展望

参考文献

致谢

附录

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