叶震璇李红梅刘水和贵州省人民医院检验科550002
摘要:目的分析以间接免疫荧光法(indirectimmunofluorescence，IIF)筛查的抗核抗体(antinuclearantibody，ANA)结果与线性免疫印迹法检测抗核抗体谱（ANAs）结果的不一致性，分析二者的相互关系方法分别采用IIF和LIA两种方法检测抗核抗体，将IIF-ANA阳性/LIA-ANAs阴性和IIF-ANA阴性/LIA-ANAs阳性患者分为自身免疫性疾病(AID)组和非AID组进行比较分析。结果189份标本中，IIF（+）/LIA阴性（-）105份，占55.56%;IIF(-)/LIA(+)84份，占44.44%。。LIA+标本中，抗核糖核蛋白/史密斯抗原(nRNP/Sm)、抗史密斯抗原(Sm)、抗干燥综合征抗原A(SS-A)、抗Ro-52、抗干燥综合征抗原B(SS-B)、抗scl-70抗原、抗11-16多肽复合体抗原（PM-scl）、抗组氨酰tRNA合成酶抗原(Jo-1)抗体、抗着丝点抗体B亚型、抗可增殖抗原抗体、抗组蛋白抗体和抗线粒体抗体M2亚型(AMA-M2)的阳性率分别为1.02%～27.55%。AID组及非AID组IIF-ANA阳性者荧光滴度分布均以1∶100～1∶320为主;荧光滴度为≥1∶1000时，2组间的差异有统计学意义(P＜0.05);AID组中IIF(+)/LIA(-)的荧光模式以细胞核均质型(H)为主，与非AID组比较，差异有统计学意义(P＜0.01);而非AID组的荧光模式以细胞核斑点型(S)为主，与AID组比较，差异无统计学意义(P＞0.05).结论IIF筛查ANA容易导致AID患者部分具有重要临床意义的ANA特异性抗体漏检，而ANA特异性抗体检测因其测定的抗体数量有限也容易导致AID患者的ANA漏检。IIFANA筛查和LIA-ANAs特异性抗体检测不能相互代替，对需要通过检测ANA来排除AID的患者标本应同时进行IIF-ANA筛查和ANAs特异性抗体的检测，以避免仅采用1种方法进行检测时导致的AID患者漏诊。
关键词：抗核抗体间接免疫印迹法线性免疫印迹法
抗核抗体（ANA）是一组将自身真核细胞的各种成分作为靶抗原的自身抗体的总称，主要存在于血清中。ANA在多种自身免疫病中均呈不同程度的阳性，如SLE、RA、MCTD、SS、等。ANA的检测在自身免疫疾病的临床诊断、鉴别诊断、评价疗效和预后估计中具有较大的意义，因此抗核抗体检测在自身免疫性疾病(AID)诊疗过程中的地位无可替代［1］。间接免疫荧光法(IIF)是检测ANA最重要的方法，被认为是ANA检测的金标准［2］。虽然IIF检测ANA不具有疾病特异性，但由于其测定的是针对细胞成分的总抗体，检测敏感度高，而被国内外众多实验室广泛采用，并作为ANA检测的筛选实验［3］。目前，国内外很多实验室为了节省检测成本，先行IIF检测，出现阳性再进一步进行ANA谱(ANAs)的测定。而在临床工作中，IIF检测ANA结果与ANAs的特异性抗体检测结果并不完全符合。因此，本研究探讨比较2种检测方法结果不一致的情况，并探讨IIF与LIA两种检测方法之间的相关性。
对象和方法
对象
收集2011年9月至2011年12月贵州省人民医院门诊和住院申请ANA谱检测的标本189份，男78例，年龄1～90岁，女131例，年龄2～78岁。确诊AID患者110例，确诊为其他疾病的非AID患者88例。所有AID患者的诊断均符合国际相关学会的诊疗指南。送检标本均为待检测患者清晨空腹静脉血，离心分离血清后同时采用IIF法检测ANA和线性免疫印迹法(lineimmunoassay，LIA)检测ANA谱15项。
试剂和仪器
试剂：德国欧蒙公司提供的抗核抗体（马赛克）检测试剂盒、自身抗体检测试剂盒（谱15）、EUROLineScan自动判别软件、EUROBlotMaster分析仪IIF检测ANA:采用HEp-2和猴肝细胞抗原片，以抗体滴度≥1∶100为阳性。
LIA检测ANAs:采用LIA检测ANAs特异性抗体，包括抗nRNP/Sm、抗Sm、抗SS-A、抗Ro-52、抗SS-B、抗Scl-70、抗PM-Scl、抗Jo-1、抗着丝点蛋白B(CENPB)、抗增殖细胞核抗原(PCNA)、抗核小体(Nukleosome)、抗组蛋白(Histone)、抗核糖体P蛋白(rRNP)、抗线粒体－M2(AMA-M2)抗体。结果采用EUROLineScan软件进行显色结果扫描分析。
统计学方法
采用SPSS17.0软件进行统计分析。IIF与LIA检测结果符合率的比较、IIF(-)/LIA(+)组与IIF(-)/LIA(±)组以及IIF不同滴度组间不同疾病患者比例的比较均采用χ2检验。
2.结果
2.1184例患者中，确诊为AID患者有110例，占59.78%，非AID患者79例，占40.22%。确诊的AID患者中IIF（+）有57例，占51.81%，非AID患者IIF（+）48例（61.06%）。在确诊的AID患者中LIA（+）有53例，占48.18%，非AID患者LIA（+）31例（38.94%）。
2.2AID组及非AID组LIA-ANAs结果分析
在确诊的110例AID患者中LIA(+)有53例，占48.18%；79例非AID患者中LIA（+）有31例，占38.94%，两者比较差异有统计学意义(P<0.05).见表1。
表1AID组及非AID组IIF(-)/LIA（+）结果分析（%）
2.3.AID组及非AID组中IIF（-）/LIA（+）患者15种自身抗体检测结果的比较
在84例IIF(－)/LIA(+)组中抗Ro-52、抗SSA、抗nRNP/Sm、抗PM-Scl抗体和抗PCNA抗体为主要阳性自身抗体，阳性率为分别为27.55%、25.51%、11.23%、11.23%和7.14%。AID组与非AID组比较两者无统计学意义（P>0.05）。见表2。
表2、AID组与非AID组各特异性抗原的比较
2.4AID组及非AID组IIF（+）、LIA（-）患者荧光滴度分析
105例IIF(+)/LIA(－)患者的荧光滴度分布均以1∶100～1∶320为主，其阳性率分别为62.86%和30.47%。而AID组荧光滴度1:320和≥1∶1000占36.84%和12.28%，高于非AID组22.91%。2组的阳性率比较在1:320时差异无统计学意义(P＞0.05);而在荧光滴度为1:100和≥1:1000时差异有统计学意义(P＜0.05)。见表3。表3AID组及非AID组IIF(+)/LIA(-)荧光滴度分析（%）
2.5AID组及非AID组IIF（+）、LIA（-）患者荧光模式分析
AID组中IIF(+)/LIA(－)者的荧光模式以混合核型、细胞核颗粒型（S）和细胞核均质型(H)为主，分别占36.84%、21.05%和17.54%，核均质组明显高于非AID组4.17%(P＜0.01),而非AID组的荧光模式以混合核型和细胞核颗粒型(S)为主，分别占33.33%和27.08%。二者差异无统计学意义(P＞0.05)，见表4。
表4AID组及非AID组IIF荧光模式分析（%）
讨论
IIF法检测的ANA是针对整个细胞核、细胞浆、细胞骨架、细胞周期等成分的总抗体，荧光核型的检测有助于相关自身抗原的确认，对临床有重要提示作用。因而被许多实验室作为ANA的经典筛选方法，但是该方法对AID没有特异性，且自动化程度低、操作标准化较难［4-5］。在临床上，很多AID患者的血清IIF检测结果可见多种荧光染色模型的重叠，可能会导致漏珍。随着技术的发展，许多ANAs特异性抗体被逐渐认识［6］，其相应的靶抗原纯化技术不断提高，LIA操作简便，易自动化，判读方便，一次可检测多种特异性自身抗体，并且有较高的敏感性和特异性。因此，作为ANA检测“金标准”的IIF法不断受到挑战。在临床实际工作中，由于检测成本因素的影响，许多实验室仅对IIF检测ANA阳性的标本再做进一步的ANAs特异性抗体检测，而在临床检测中，IIF检测ANA与LIA检测自身抗体结果不完全符合。本次研究是对ANA与LIA两种检测方法的结果不一致性进行比较分析，探讨二者之间的关系。本次研究发现两种检测结果并不完全一致，不能相互替代。以HEp-2细胞为抗原基质检测ANA时，基质中的抗原存在分布不均、含量过低以及不同固定方法对特定抗原的破坏等因素的影响，可能导致部分特异性抗体的漏检。如果实验室以IIF作为ANA初筛试验，初筛阳性后再进行ANAs特异性抗体检测，容易造成一部分ANA假阴性的患者中有重要临床意义的ANAs特异性抗体漏检，导致AID患者的误诊、漏诊［7］。另一方面，由于LIA-ANAs检测的特异性抗体数量极其有限，而AID患者体内存在的自身抗体多达上百种，从理论上分析该方法不能代替针对总抗体的IIF-ANA检测。
本研究的IIF(-)/LIA（+）组84例患者中，AID患者有53例，占48.18%；非AID31例，占38.94%，且差异有统计学意义。该结果表明:在IIF(-)/LIA（+）患者中，存在大量AID患者，当IIF阴性时也有必要进行LIA-ANA检测，ANA的IIF检测无法替代ANAs的特异性抗体检测。本研究的IIF(-)/LIA（+）组84份标本特异性抗体结果表明，IIF检测ANA可导致几乎所有种类的ANAs特异性抗体漏检，其中最容易漏检的特异性抗体为抗Ro-52、抗SS-A，其次抗nRNP/Sm、抗PM-Scl抗体和抗PCNA抗体。这些漏检的特异性抗体都具有重要的临床意义，因此，无论从不同检测方法的本质特征还是从实际临床意义来看，IIF-ANA的检测不能完全代替LIA-ANAs的检测［3］。若仅用ANAs特异性抗体检测结果来直接代替针对总抗体的ANA筛查实验也会造成一部分患者ANA假阴性结果，导致AID患者的漏诊。本研究中IIF-ANA(+)/LIA-ANAs（-）组105例患者中AID患者57例，占54.29%，高于非AID患者45.71%。进一步的IIF不同滴度与疾病关系结果表明，IIF滴度1∶100、1∶320、≥1∶1000各组中，AID患者的比例均高于非AID患者，在荧光滴度≥1∶1000时差异有统计学意义。无论从临床意义还是不同检测方法的特征来看，LIA-ANAs的特异性抗体检测不能完全代替IIF-ANA的筛查。因此，当自身抗体检测结果阳性，提示该患者是AID的高危人群，应长期随访、密切观察，这也符合目前对于疾病早期发现、早期治疗的诊疗原则。总之，ANAs特异性抗体检测具有疾病特异度和较高的检测敏感度，而IIF-ANA筛查具有抗体检测的全面性。无论是从方法学角度还是实际临床意义分析，本次分析结果均表明IIF-ANA筛查和LIA-ANAs特异性抗体检测不能相互代替，临床应对需要通过检测ANA来排除AID患者的标本同时进行IIF-ANA的筛查和LIA-ANAs的检测，以避免仅用一种方法检测导致的AID患者漏诊。
参考文献
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