青岛文昌鱼体液酚氧化酶：分离、纯化、鉴定、诱导形成及其基因克隆

论文摘要

酚氧化酶（phenoloxidase）又称为酪氨酸酶（tyrosinase , EC1. 14. 18. 1）。它是一种含铜的酶,能够催化单酚羟化成二酚（如多巴）,把二酚氧化成醌;醌在非酶促条件下形成最终的反应产物黑色素（Lerch K,1988）。酚氧化酶在脊椎动物和无脊椎动物中得到了广泛的研究,然而在进化上占据关键位置的文昌鱼中的酚氧化酶的研究却比较少。我们实验室以前的研究证实文昌鱼皮肤粘液中存在酚氧化酶和酚氧化酶原,并对其组织分布和抗菌活性及其在胚胎发育过程中的变化进行了研究。然而,在文昌鱼体液中是否存在酚氧化酶（一种可能在文昌鱼的免疫和防御系统中担任重要角色的酶）,目前还不清楚。我们以青岛文昌鱼（Branchiostoma belcheri tsingtauense）为实验材料,首先,用分光光度法和电泳与生化染色相结合技术检测,发现酚氧化酶存在于文昌鱼体液中,且主要以酶原形式存在;其最适温度是30℃-35℃,最适pH是7.0-7.5。酚氧化酶原可以被外源性激活剂如胰蛋白酶、酵母聚糖和脂多糖激活;在10 mM钙离子存在,外源激活剂引起的激活作用明显增强。但是外源激活剂引起的激活作用可以被蛋白酶抑制因子（STI和pNPGB）所抑制。另外,非变性电泳结合酶特异性染色证明酚氧化酶分子量约150 kDa,变性后为三条带,其分子量约44、46和72 kDa。这是有关对头索动物文昌鱼体液中存在酚氧化酶和酚氧化酶原的首次报道。为进一步研究文昌鱼体液中酚氧化酶的特性,我们用硫酸氨分级沉淀、凝胶过滤层析、离子交换层析三种分离纯化技术相结合,从文昌鱼体液中纯化出了酚氧化酶。纯化的酚氧化酶用非变性电泳显示一条分子量约150 kDa的带,而变性后为三条带,其分子量约44,46和72 kDa。这说明文昌鱼体液中的酚氧化酶可能是一个通过二硫键连接的异三聚体蛋白。底物特异性和抑制剂实验的研究证明文昌鱼体液中酚氧化酶氧化o-diphenols（如Dopamine和4-methylcatechol）的活性较强,而氧化p-diphenols（如Hydroquinone和Methylhydroquinone）的活性较弱;且苯硫脲能强烈抑制体液中酚氧化酶活性,而叠氮化钠对其活性抑制较弱;由此推测文昌鱼体液中酚氧化酶可能是一种酪

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摘要

Abstract

缩略语

第一章文献综述

1 引言

2 酚氧化酶原和酚氧化酶

3 酚氧化酶原相关蛋白

4 酚氧化酶原激活系统的调控

5 本论文研究的目的及意义

6 本论文的研究方案及技术路线

第二章青岛文昌鱼体液中酚氧化酶的检出及其鉴定

1 前言

2 材料与方法

2.1 实验仪器和试剂

2.2 文昌鱼体液的提取

2.3 分光光度法检测酚氧化酶活性

2.4 电泳与生化染色相结合检测酚氧化酶活性

2.5 激活剂对酚氧化酶活性的影响

2.6 蛋白酶抑制因子对酚氧化酶活性的影响

2.7 温度对酚氧化酶活性的影响

2.8 pH 对酚氧化酶活性的影响

2.9 数据处理

3 结果

3.1 文昌鱼体液中酚氧化酶活性的检出

3.2 不同激活剂对酚氧化酶活性的影响

3.3 蛋白酶抑制因子对酚氧化酶活性的影响

3.4 最适温度和最适pH

4 讨论

第三章青岛文昌鱼体液中酚氧化酶的纯化鉴定及其特性分析

1 前言

2 材料与方法

2.1 实验仪器和试剂

2.2 文昌鱼体液的提取

2.3 酚氧化酶的分离纯化

2.4 酚氧化酶活性的测定

2.5 PAGE 电泳测定酚氧化酶的纯度和分子量

2.6 电泳及其酶染色

2.7 抑制剂对酚氧化酶活性的影响

2.8 酚氧化酶的底物特异性

2.9 酚氧化酶多克隆抗体的制备

2.10 蛋白浓度的测定

2.11 数据处理

3 结果

4 讨论

第四章免疫诱导对青岛文昌鱼体液中酚氧化酶活力的影响

1 前言

2 材料与方法

2.1 实验仪器和试剂

2.2 培养基

2.3 实验材料

2.4 菌悬液的制备

2.5 细菌诱导

2.6 文昌鱼体液的提取

2.7 分光光度法测体液中酚氧化酶活性的变化

2.8 电泳和酶染色

2.9 光密度扫描图

2.10 蛋白浓度的测定

2.11 数据处理

3 结果

4 讨论

第五章酚氧化酶基因的cDNA 克隆及其进化分析

1 前言

2 材料与方法

3 结果

3.1 文昌鱼总RNA 的提取

3.2 文昌鱼酚氧化酶基因的序列和结构

3.3 序列比较与系统进化树

4 讨论

总结与展望

参考文献

附录

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致谢

青岛文昌鱼体液酚氧化酶：分离、纯化、鉴定、诱导形成及其基因克隆

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