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鸭α-干扰素核酸疫苗在鸭体内的动态分布及表达产物抗鸭瘟强毒效果初探

2020-11-24阅读(446)

鸭α-干扰素核酸疫苗在鸭体内的动态分布及表达产物抗鸭瘟强毒效果初探

论文摘要

28日龄北京鸭分别通过肌肉注射50μg、100μg和200μg和基因枪轰击免疫1μg、3μg和6μg鸭α-干扰素核酸疫苗（pcDNA-SDIFN-α），同时设PBS和空载体pcDNA3.1（+）对照。免疫后不同时间分别采集鸭的血清以及全血和各部分组织（心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、法氏囊、胸腺、哈氏腺、胰脏、十二指肠、空肠、回肠、直肠、盲肠、脑和免疫注射部位的组织）。进行如下研究：①建立一种能检测pcDNA-SDIFN-α的实时荧光定量PCR（FQ-PCR）方法，并应用于pcDNA-SDIFN-α在免疫鸭体内动态分布的检测。②pcDNA-SDIFN-α经不同剂量不同途径免疫鸭的体内表达产物（免疫血清）抗鸭瘟强毒致鸭成纤维细胞病变的能力。获得的结果如下：1．建立的检测pcDNA-SDIFN-α的FQ-PCR方法具有良好的特异性，重复性好，检测的线性范围宽，能检测到7.7×101～7.7×109copies／μL，可用于对鸭体内的pcDNA-SDIFN-α进行定量检测。2．通过肌肉注射和基因枪轰击免疫鸭的各组织中均在免疫后1h检测到pcDNA-SDIFN-α的分布，且含量最高的组织均是在免疫注射部位，其中肌肉注射免疫50μg、100μg和200μg组中最高拷贝数分别为9.1×107copies／g、1.48×108copies／g和1.78×108；基因枪免疫1μg、3μg和6μg组中最高拷贝数分别为1.0×108copies／g、2.51×108copies／g和3.02×108copies／g。肌肉注射免疫与基因枪轰击免疫均是良好的免疫方式。3．除血液外，随着免疫时间的推移，pcDNA-SDIFN-α在组织中的含量达到最高后呈现逐渐减少的趋势，免疫后前7d期间减少最明显。210d除部分组织外，依然能够检测到核酸疫苗的存在，但含量很低，每克组织中pcDNA-SDIFN-α拷贝数仅有101左右。全血中的pcDNA-SDIFN-α含量一直较低，在1h-105d时，总体也呈减少趋势，但拷贝数变化差异不显著（P＞0.05）；210d时与其他组织中的含量差异不显著（P＞0.05）。在整个检测时间段，免疫部位pcDNA-SDIFN-α的含量减少的最多，减少了约6-7个数量级，其它组织中的含量也减少了约2-5个数量级。4．不同剂量肌肉注射免疫组与基因枪轰击免疫组各组织器官中pcDNA-SDIFN-α的含量呈现的总体规律为：肌肉组：200μg组＞100μg组＞50μg组；基因枪组：6μg组＞3μg组＞1μg组，但差异均不显著（P＞0.05）。5．PBS对照和空载体pcDNA3.1（+）对照组的各组织器官所有时间点均未检测到pcDNA-SDIFN-α。6．在免疫后1d-63d，表达产物作用于鸭胚成纤维细胞后，pcDNA-SDIFN-α试验组的鸭瘟病毒的含量均低于PBS和空载体对照组的病毒含量，且在免疫后3d到21d时的表达产物作用后，DPV病毒含量比对照组的减少最多，表明在免疫后3d到21d时的表达产物抑制病毒的能力最明显，最高抑制病毒量约108copies／100μL细胞中。肌肉注射组在7d时的表达产物有最高的抑制鸭瘟强毒的能力，基因枪免疫组在3d时的表达产物抑制鸭瘟强毒的能力最强。7．不同剂量肌肉注射免疫组与基因枪轰击免疫组表达产物抑制病毒能力：肌肉组：200μg组＞100μg组＞50μg组；基因枪组：6μg组＞3μg组＞1μg组。表明以相同的免疫方式核酸疫苗的表达产物量与注射剂量呈现正相关。8．200μg肌肉注射组与6μg基因枪免疫组的各组织中pcDNA-SDIFN-α含量差异不显著（P＞0.05）；6μg组基因枪轰击免疫组与200μg组表达产物抑制病毒能力相当，1μg组基因枪轰击免疫组与50μg肌肉注射组表达产物抑制病毒能力也相当，表明基因枪免疫比肌肉注射免疫效率高约40倍。

论文目录

  • 本论文的创新性研究工作
  • 中文摘要
  • ABSTRACT
  • 1 前言
  • 1.1 干扰素的研究概况
  • 1.1.1 干扰素的分类、一般特性和生物学活性
  • 1.1.2 干扰素抗病毒作用的机制
  • 1.2 家禽干扰素核酸疫苗的研究进展
  • 1.3 实时荧光定量PCR技术
  • 1.4 核酸疫苗的免疫方式
  • 1.5 关于鸭瘟病毒
  • 1.6 本实验的研究意义
  • 2 试验材料
  • 2.1 实验动物
  • 2.2 质粒、菌株与鸭瘟强毒
  • 2.3 实验仪器与试剂
  • 2.4 实验试剂的配制
  • 2.5 引物与探针
  • 2.5.1 定量PCR检测pcDNA-SDIFN-α的引物与探针
  • 2.5.2 定量PCR检测鸭瘟病毒的引物与探针
  • 3 试验方法
  • 3.1 质粒的大量提取与纯化
  • 3.1.1 质粒的大量提取
  • 3.1.2 质粒的纯化
  • 3.2 含pcDNA-SDIFN-α的基因枪子弹的制备
  • 3.3 实验鸭免疫分组设计
  • 3.4 采样时间与部位
  • 3.5 TaqMan探针定量PCR检测pcDNA-SDIFN-α方法的建立
  • 3.5.1 FQ-PCR引物合理性的验证
  • 3.5.2 引物与探针的设计
  • 3.5.3 质粒标准品的制备
  • 3.5.4 定量PCR检测pcDNA-SDIFN-α反应条件的建立与优化
  • 3.5.5 TaqMan探针定量PCR检测pcDNA-SDIFN-α重复性与特异性检测
  • 3.5.6 TaqMan探针定量PCR检测pcDNA-SDIFN-α标准曲线的建立
  • 3.5.7 TaqMan探针定量PCR检测pcDNA-SDIFN-α线型范围的确定
  • 3.6 样品处理及样品中模板DNA的提取
  • 3.6.1 血液样品中pcDNA-SDIFN-α模板的提取
  • 3.6.2 组织样品中pcDNA-SDIFN-α模板的提取
  • 3.7 样品中pcDNA-SDIFN-α的检测分析
  • 3.8 pcDNA-SDIFN-α体内表达产物体外抗DPV强毒效果的研究
  • 3.8.1 表达产物的提取与预处理
  • 3.8.2 鸭瘟种毒TCID50的检测
  • 3.8.3 抗DPV强毒效果试验设计
  • 3.8.4 培养鸭胚成纤维细胞及病毒含量检测
  • 3.9 数据处理
  • 4 结果
  • 4.1 纯化的pcDNA-SDIFN-α鉴定电泳图
  • 4.2 定量PCR检测干扰素核酸疫苗在鸭体内动态分布规律方法建立
  • 4.2.1 FQ-PCR引物合理性的验证
  • 4.2.2 FQ-PCR检测干扰素核酸疫苗方法条件的优化
  • 4.2.3 FQ-PCR检测干扰素核酸疫苗重复性与特异性
  • 4.2.4 实时荧光定量PCR标准曲线的建立
  • 4.2.5 实时荧光定量PCR线性分析
  • 4.3 pcDNA-SDIFN-α免疫后鸭的临床表现
  • 4.4 实时荧光定量PCR对鸭体内pcDNA-SDIFN-α的定量检测
  • 4.4.1 pcDNA-SDIFN-α以不同剂量肌肉注射后在鸭体内的动态分布情况
  • 4.4.2 pcDNA-SDIFN-α以不同剂量基因枪免疫鸭后在鸭体内的动态分布情况
  • 4.5 pcDNA-SDIFN-α鸭体内表达产物在细胞水平上抗鸭瘟强毒能力
  • 4.5.1 肌肉注射组不同剂量不同时间表达产物抗DPV强毒能力
  • 4.5.2 基因枪轰击免疫组不同剂量不同时间表达产物抗DPV强毒能力
  • 5 讨论
  • 5.1 选用实时荧光定量PCR检测技术
  • 5.2 引物的设计
  • 5.3 肌肉注射免疫与疫苗的分布及表达产物抗病毒能力
  • 5.4 基因枪轰击免疫与疫苗的分布及表达产物抗病毒能力
  • 5.5 pcDNA-SDIFN-α在组织器官中不同时间的分布规律
  • 5.6 研究鸭α-干扰素核酸疫苗及其在免疫鸭体内分布规律的意义
  • 5.7 pcDNA-SDIFN-α在鸭体内表达产物抗病毒能力的研究
  • 5.8 不同免疫途径表达产物的抗病毒效果
  • 6 结论
  • 参考文献
  • 附
  • 致谢
  • 攻读学位期间发表的学术论文目录

    • 相关论文文献

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