马链球菌兽疫亚种新保护性抗原的鉴定

论文摘要

马链球菌兽疫亚种（Streptococcus equi ssp. zooepidemicus, SEZ）属于兰氏分群的C群β溶血链球菌,能够感染多种动物及人类。在我国,该菌是猪链球菌病的主要病原,能引起猪的脑膜炎、败血症、关节炎、心内膜炎及突发性死亡,并对相关从业人员的健康构成潜在威胁。尽管目前国内市场上已有多种预防C群链球菌疫苗,但其免疫保护效果往往不能令人满意,因此安全、高效的新型疫苗仍有待研究。本实验室已采用免疫蛋白组学方法筛选马链球菌兽疫亚种ATCC35246株细胞壁相关蛋白,并成功鉴定出10种免疫原性蛋白。多数蛋白在马链球菌兽疫亚种上未曾见报道,其是否为保护性抗原仍需进一步鉴定。本文根据GenBank上已公布的这10种蛋白的基因序列,分析选择免疫原性较好部分的基因序列设计并合成引物。以马链球菌兽疫亚种ATCC35246株基因组DNA为模板,通过PCR技术,扩增出目的基因并定向克隆至表达载体pET-32a（+）、pET-28a（+）中,然后将重组质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）。通过PCR鉴定和重组质粒双酶切鉴定后,挑取阳性克隆菌进行IPTG诱导表达。经SDS-PAGE鉴定,目的蛋白均获得良好的表达,大小与预期值一致。Western-blot显示,融合蛋白均可被猪源ATCC35236株康复血清识别,表明其具有天然蛋白的部分抗原性。重组融合蛋白经亲和层析纯化后,与等量ISA206佐剂进行乳化。通过皮下免疫途径分组免疫ICR小鼠,并以ATCC35246全菌灭活苗和PBS作为对照组。用间接ELISA法检测小鼠血清IgG抗体,并通过体外调理吞噬试验测定抗血清的调理活性。结果表明重组蛋白免疫小鼠后能有效产生免疫应答,血清中抗体水平有明显升高,且有良好的补体依赖的调理吞噬功能。二免后以5LD50 ATCC35246强毒株进行腹腔攻击,结果显示试验组存活率优于PBS对照组,其中免疫EF-G融合蛋白组小鼠的保护率达到50%,免疫TF、TK、GAPDH、PPH融合蛋白组均达到37.5%,表明原核表达产物免疫ICR小鼠,可使其对同源菌株攻击产生一定的保护作用,在亚单位疫苗研制中具有应用价值。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一篇 文献综述
• 第一章 马链球菌兽疫亚种与猪链球菌病的研究进展
• 1 病原学
• 2 流行病学
• 3 临床症状及病理变化
• 3.1 临床症状
• 3.2 病理变化
• 4 毒力因子与致病机理
• 4.1 类M蛋白
• 4.2 纤维结合素结合蛋白
• 4.3 IgG结合蛋白
• 4.4 透明质酸荚膜
• 4.5 链激酶
• 4.6 金属结合脂蛋白
• 5 猪链球菌病的诊断
• 5.1 分离培养及生化鉴定
• 5.2 血清学鉴定
• 5.3 分子鉴定
• 5.3.1 聚合酶链式反应
• 5.3.2 脉冲场凝胶电泳法
• 5.3.3 多位点酶电泳法
• 5.3.4 多位点序列分型
• 6 猪链球菌病的防治
• 6.1 药物治疗
• 6.2 疫苗的研究进展
• 6.2.1 弱毒苗
• 6.2.2 全菌灭活苗
• 6.2.3 基因工程苗
• 7 小结
• 参考文献
• 第二篇 研究报告
• 第二章 马链球菌兽疫亚种新鉴定免疫原性蛋白的原核表达
• 1 材料
• 1.1 菌株与质粒
• 1.2 主要酶和试剂
• 1.3 主要仪器设备
• 1.4 引物设计及合成
• 2 方法
• 2.1 模板DNA的提取
• 2.2 PCR扩增
• 2.3 PCR扩增产物的回收
• 2.4 质粒的提取
• 2.5 重组质粒构建
• 2.5.1 PCR扩增产物和质粒的双酶切
• 2.5.2 连接
• 2.5.3 感受态细胞的制备
• 2.5.4 连接产物的转化
• 2.5.5 重组质粒的鉴定
• 2.6 重组融合蛋白的诱导表达
• 2.7 SDS-PAGE检测重组融合蛋白的表达
• 2.7.1 制胶
• 2.7.2 上样与电泳
• 2.7.3 染色与脱色
• 2.8 重组融合蛋白的纯化与复性
• 2.8.1 重组菌的大量诱导
• 2.8.2 包涵体的纯化
• 2.8.3 上清的纯化
• 2.8.4 融合蛋白的复性
• 2.9 重组融合蛋白免疫印迹
• 3 结果
• 3.1 PCR扩增结果
• 3.2 重组菌的PCR鉴定和双酶切鉴定结果
• 3.3 重组质粒在BL21中的表达
• 3.4 融合蛋白的纯化与鉴定
• 4 讨论
• 参考文献
• 第三章 马链球菌兽疫亚种新鉴定免疫原性蛋白对小鼠的免疫效力评价
• 1 材料
• 1.1 菌种
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器
• 1.4 试验动物
• 2 方法
• 2.1 菌株的复壮
• 50的测定'>2.2 ATCC35246株LD₅₀的测定
• 2.3 免疫原的制备
• 2.3.1 全菌苗及亚单位疫苗的制备
• 2.3.2 无菌检验与安全检验
• 2.4 小鼠的主动免疫保护性试验
• 2.4.1 小鼠的免疫
• 2.4.2 攻毒试验
• 2.5 ELISA检测重组融合蛋白抗体效价
• 2.5.1 血清样本的采集
• 2.5.2 小鼠抗体动态效价测定
• 2.6 调理吞噬试验
• 2.6.1 小鼠腹腔巨噬细胞的制备
• 2.6.2 细菌悬液制备
• 2.6.3 调理吞噬
• 2.7 统计学分析
• 3 结果
• 3.1 菌株的复壮
• 50'>3.2 ATCC35246株对ICR小鼠的LD₅₀
• 3.3 安全性检验
• 3.4 重组蛋白对小鼠的免疫保护效力试验
• 3.5 ELISA检测重组蛋白抗血清效价
• 3.6 调理吞噬试验
• 4 讨论
• 参考文献
• 全文总结
• 附录
• 致谢