线粒体氧化应激信号通路参与缺糖缺氧诱导内皮细胞凋亡调控机制研究

论文摘要

背景:以脑血管内皮损伤为病变基础的缺血性脑中风,随着我国社会老龄化进展,发病率和死亡率不断攀升,是严重危害我国人民生命健康的重大疾病。脑血管内皮细胞氧化应激损伤是缺血性脑中风发生发展中的重要病理现象。近年来越来越多的研究显示线粒体在介导细胞凋亡的过程中发挥了极为重要的作用,位于线粒体内外膜间隙凋亡相关分子释放是线粒体介导的凋亡过程中的关键事件,可以引起细胞结构和功能的广泛损害。我们前期研究结果发现缺血性脑中风在发生发展过程中,钙离子、钙调素依存的一氧化氮合酶（Nitric oxide synthase,NOSs）被激活,伴有合成大量一氧化氮（Nitric oxide,NO）生成,NO在体内可与超氧阴离子（Superoxide,O2-）快速结合生成过氧亚硝基阴离子（peroxynitrite,ONOO-）,参与脑血管内皮损伤、血脑屏障破坏及细胞凋亡过程。另外,脑血管内皮细胞内存在高密度的线粒体来维持正常的生理活动,线粒体呼吸功能下降是各种脑系疾病的早期现象;神经系统疾病发生发展中线粒体内外膜间隙的凋亡相关分子释放与调控处于线粒体氧化应激损伤的关键部位,已经受到生物医学研究领域的极大关注,但关于酪氨酸蛋白硝基化与线粒体氧化应激损伤的内在关联性研究尚未阐明。根据文献报道,Omi/HtrA2（oocyte maturation inhibitor/the high temperature requirement factor A2）是一种线粒体丝氨酸蛋白水解酶,当细胞受到刺激发生应激反应时线粒体膜通透性增加,并与X连锁凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor ofapoptosis protein,XIAP）等相互作用,继发激活caspase原,最终导致细胞死亡。XIAP的脑保护作用可能与其能够直接与启动性caspase（caspase-9）和效应性caspase（caspase-3、caspase-7）结合并抑制其活性有关。此外,PED/pea-15（phosphoprotein enriched in diabetes/phosphoprotein enriched in astrocytes）的生物功能的多样性和翻译后调控及对Omi/HtrA2介导的下游细胞凋亡级联反应的制衡作用也被关注。目的:通过构建缺糖缺氧（Oxygen-Glucose Deprivation,OGD）内皮细胞损伤模型,探索内皮损伤病理状态下ONOO-介导的酪氨酸硝基化与线粒体氧化应激损伤信号转导的内在关联性及线粒体Omi/HtrA2-PED/pea-15的平衡紊乱对下游细胞XIAP-caspases凋亡级联反应的调控机制,并利用基因芯片技术对氧化应激损伤后的多基因表达变化进行探索性研究,为脑缺血疾病的预防及治疗提供理论性研究依据。方法:在OGD条件下,分别处理内皮细胞1 h,3 h,6 h,12 h和24 h,然后通过MTT法分别检测细胞存活分数;通过光镜,透射电镜,JC-1（5,5’,6,6’-tetrachloro-1,1’,3,3’tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide）染色等方法观察经OGD处理不同时间后内皮细胞表型变化;通过流式细胞仪定量测定线粒体膜电位变化;在分子生物学机制方面,通过Western-blot法法及免疫定位染色法检测相关蛋白表达。OGD处理6 h前,分别加入ONOO-的清除剂尿酸（Uric acid,UA）,Omi/HtrA2的特异性阻断剂ucf-101,观察细胞的存活分数的改变情况;通过Western-blot法检测相关蛋白表达;在检测凋亡率方面,通过Annexin V/PI染料进行流式定量检测。在研究内皮细胞多基因表达变化方面,采用基因芯片技术进行检测。结果:光镜、电镜、JC-1结果分别显示经OGD处理后,血管内皮细胞逐渐拉长,变细,细胞间隙变大,细胞核由规则的圆形变成不规则的多边形,并出现染色质边聚现象,线粒体出现肿胀、变形,线粒体膜电位下降明显;Western-blot结果显示内皮细胞经OGD诱导3 h后,细胞质Omi/HtrA2显著显著增加,并且至少在24 h内尤为显著,线粒体Omi/HtrA2随着OGD诱导时间延长而减少。内皮细胞内的XIAP自OGD诱导3 h后显著下调。pro-caspase3和pro-caspase9,PED/pea15蛋白在OGD诱导后随之减少。同时,MMP-9在OGD处理较短时间内（3 h）被激活。免疫定位染色结果显示OGD诱导6 h后线粒体内Omi/HtrA2荧光强度明显减弱。加入ucf-101后,细胞存活分数与OGD 6 h组相比略有提高,但无显著性差异。加入UA后,细胞存活分数显著提高并且两药合用后效果最为明显;Western-blot结果显示,当加入UA及两药合用后,细胞质Omi/HtrA2、cleaved-caspase 3及硝基化酪氨酸蛋白下调明显,而XIAP、PED/pea15、、pro-caspase-3则出现了显著的上调。间质金属酶（GelatinaseB,MMP-9）和nitrotyrosine蛋白表达也随着UA的加入出现显著的下调趋势。基因芯片结果显示以caspase家族为代表的多种基因分别出现了上调及下调趋势。结论:以上结果提示在缺糖缺氧条件下,诱导了内皮细胞以线粒体依赖的内皮细胞凋亡程序的发生。Omi/HtrA2由线粒体向胞浆外释放增多,胞浆Omi/HtrA2与PED/pea15结合及水解酶作用后将会加速抗凋亡蛋白PED/pea15的降解。随着体内Omi/HtrA2- PED/pea15的稳态失衡,将进一步触发Omi/HtrA2介导的下游内皮细胞凋亡事件,包括抑制XIAP的表达,进而导致capase-9活化,并使下游caspase-3活化。同时,我们观察到缺糖缺氧条件下伴有ONOO-的过度产生,ONOO-的特异性抑制剂UA有效阻断了Omi/HtrA2-PED/pea15的稳态失衡及Omi/HtrA2介导的下游内皮细胞凋亡过程。此外,Omi/HtrA2处于凋亡过程的下游事件,因此单纯抑制Omi/HtrA2活性并不能有效逆转凋亡。我们的研究提示,ONOO-诱导的氧化应激损伤处于其上游环节并占主导地位,ONOO-通过硝基化反应导致线粒体膜电位的改变,并与粒体内部的Omi/HtrA2发生硝基化反应,进一步在Omi/HtrA2-PED/pea15的稳态失衡起调控作用。鉴于在内皮细胞缺糖缺氧损伤环节中,多因素参与线粒体氧化应激损伤过程,相关诱导机制将结合基因芯片分析结果进行进一步深入研究。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• 英文摘要
• 引言
• 实验仪器与材料
• 1、实验材料
• 2、主要试剂与仪器
• 实验方法
• 1、人脐静脉血管内皮细胞培养
• 2、缺糖缺氧诱导血管内皮细胞损伤时效实验
• 3、JC-1染色检测缺糖缺氧条件下线粒体膜电位
• 4、免疫细胞化学法检测氧化应激相关蛋白
• 5、流式细胞术定量检测测细胞线粒体膜电位变化和血管内皮细胞凋亡率
• 6、Western-blot检测氧化应激关联蛋白表达
• 7、透射电镜观察
• 8、基因芯片样本处理
• 9、数据统计
• 第一部分 血管内皮细胞缺糖缺氧模型建立及线粒体氧化应激信号通路参与内皮细胞凋亡机制研究
• 1 实验结果
• 1.1、缺糖缺氧处理不同时间后血管内皮细胞存活分数
• 1.2、缺糖缺氧处理不同时间后血管内皮细胞表型变化
• 1.2.1 缺糖缺氧处理不同时间细胞形态学变化
• 1.2.2 电镜观察缺糖缺氧条件下血管内皮细胞亚细胞结构变化
• 1.2.3 缺糖缺氧处理不同时间线粒体膜电位变化情况
• 1.2.4 Western blot检测缺糖缺氧条件下相关蛋白表达变化
• 1.2.5 免疫细胞化学检测缺糖缺氧条件下Omi/HtrA2表达变化
• 2、实验小结
• 第二部分 血管内皮细胞损伤信号途径的内在关联性及药物调控
• 1、实验结果
• 1.1、细胞兰检测药物靶点调控对血管内皮细胞存活分数影响
• 1.2、Western blot法检测药物靶点调控对血管内皮细胞损伤信号途径关联蛋白表达变化
• 1.3、Annexin/PI检测药物靶点调控对血管内皮细胞凋亡
• 2、实验小结
• 第三部分 展望性研究:利用基因芯片技术高通量检测参与介导血管内皮细胞损伤的基因谱表达
• 1.实验结果
• 1.1、缺糖缺氧条件下相对于对照组上下调基因表达情况
• 1.2、缺氧低糖条件下基因表达变化从不同生物学特点进行功能分类
• 1.3、缺氧低糖条件下主要病理机制相关的Pathway
• 1.4、缺氧低糖条件下主要病理机制相关Pathway中的候选靶点基因
• 2、实验小结
• 讨论
• 论文创新点
• 参考文献
• 综述
• 作者简历及在读期间所取得的科研成果