水稻基因聚合育种及cry1Ab基因在转基因水稻中的分子标记定位研究

论文摘要

水稻是世界上最重要的粮食作物之一,全球约二分之一的人口以稻米为主食,水稻也是受病虫害最多的作物之一。由Xanthomonas oryzae pv. oryzae引起的水稻白叶枯病是世界范围的细菌性病害,严重影响水稻的产量和品质。水稻每年因鳞翅目害虫（二化螟、三化螟、稻纵卷叶螟、稻螟蛉、稻苞虫等）为害造成的损失占总产量的10%-30%。另外,杂交稻纯度和稻田杂草影响水稻的产量与品质,使用除草剂费工费力,增加了生产成本,已成为生产上的主要问题。抗病、抗虫、抗除草剂转基因水稻的培育为水稻的高产与稳产提供重要保证的同时,可以减少化学农药的使用,改善环境质量。实践证明,将多个抗性基因聚合在同一水稻品种中能有效提高水稻的抗性和保持抗性持久,分子标记辅助选择以其快速、准确的选择优势成为实现基因聚合育种的有效手段。对转基因水稻中外源转cry1Ab基因进行定位,构建转cry1Ab基因水稻的分子遗传图谱,可为转cry1Ab基因水稻的培育进行标记辅助选择提供更多的分子标记,同时为研究转cry1Ab基因水稻的基因组变化,进行转基因水稻中外源基因的位置效应奠定基础,为转cry1Ab基因水稻生物安全性评价提供更多的理论支撑。本论文主要开展了三个方面的研究:多抗性（抗白叶枯、螟虫、除草剂）转基因水稻恢复系的培育;水稻香味基因与抗白叶枯基因的聚合育种;转基因水稻中转cry1Ab基因的分子标记定位。主要研究结果如下:1.多抗性（抗白叶枯、螟虫、除草剂）转基因水稻恢复系的培育（1）将恢773与携有转cry1Ab和bar基因的水稻新品系中国91（cry1Ab）杂交,并以恢773作为轮回亲本,连续回交三代和自交一代,对各回交世代的单株进行cry1Ab和bar基因的PCR分析、田间抗虫性鉴定和除草剂Basta抗性鉴定,经过选择获得了转基因水稻恢复系T773-1,田间种植对螟虫及除草剂Basta表现很好的抗性。（2）将恢773与带有转Xa21基因的水稻新品系豫粳6（Xa21）杂交,并以恢773作为轮回亲本,连续回交三代和自交一代,经过PCR分析、GUS活性测定和白叶枯病菌接种鉴定,获得带有Xa21基因的并具有优良农艺性状的转基因水稻恢复系T773-2,田间种植表现很好的水稻白叶枯病抗性。（3）转cry1Ab和bar基因的水稻恢复系T773-1和转Xa21基因的恢复系T773-2进行杂交、自交,对自交世代单株进行cry1Ab、bar和Xa21基因的分子标记辅助选择,获得了带有三基因的恢复系T773,田间种植对水稻白叶枯病、鳞翅目害虫、除草剂具有很好的抗性。并利用恢复系T773与不育系早花2A进行杂交,进行配合力测定,获得了抗白叶枯病、螟虫与除草剂的多抗转基因水稻恢复系T773。T773及其杂交后代的抗谱和抗性水平达到其抗性基因供体亲本的水平,抗性改良效果明显。2.水稻香味基因与抗白叶枯基因的分子标记聚合育种通过分子标记辅助选择与传统的杂交育种技术有机结合,将香稻栽培品种香粳9407与抗白叶枯病多基因聚合系IRBB60（Xa4、xa5、xa13、Xa21）进行杂交、自交,采用田间病原菌接种鉴定和香味鉴定筛选,结合农艺性状考查进行选择,在自交F2代获得两个抗白叶枯基因和香味基因聚合系（2R+fgr）1株;在自交F3代获得四个抗白叶枯基因和香味基因聚合系（4R+fgr）1株,三个抗白叶枯基因和香味基因聚合系（3R+fgr）2株,两个抗白叶枯基因和香味基因聚合系（2R+fgr）7株,一个抗白叶枯基因和香味基因聚合系（1R+fgr）3株;在自交F4代获得四个抗白叶枯基因和香味基因聚合系（4R+fgr）10株,三个抗白叶枯基因和香味基因聚合系（3R+fgr）28株,两个抗白叶枯基因和香味基因聚合系（2R+fgr）20株。获得的多基因聚合系单株高抗水稻白叶枯病并且具有浓郁的香味,主要农艺性状优良,可直接应用于抗白叶枯病香稻育种,对水稻抗性育种和品质改良具有重要的实践意义。3.转基因水稻中转cry1Ab基因的分子标记定位（1）首先利用纯合稳定的转cry1Ab基因的中国91株系与IRBB60杂交,对其F2代分离群体的单株进行除草剂Basta抗性检测,结果显示,在F2代分离群体中cry1Ab基因的分离符合期望的3:1分离比例,遵循孟德尔分离规律,证明了cry1Ab基因在转基因株系中以单显性位点整合。（2）利用Tail-PCR技术获得转基因水稻中外源cry1Ab基因插入的侧翼序列,通过序列比较分析确定了转cry1Ab基因在水稻基因组插入的物理位置。根据插入位置附近的水稻基因组序列进行微卫星序列的搜索,并利用Primer Premier 5.0软件设计了24对SSR标记引物。（3）利用设计的24对SSR引物对亲本转cry1Ab基因的水稻中国91与IRBB60之间进行多态性筛选,获得了6对多态性引物,然后利用这6对引物以及公开引物RM1261对杂交的F2代分离群体240个单株进行分析。依据每个单株的基因型和表型数据,利用MAPMAKER/EXP Version 3.0软件进行分析,构建了外源转基因cry1Ab在水稻第12染色体的遗传图谱,外源cry1Ab基因被定位在标记CM22和RM1262之间,两个标记相距9.8cM。微卫星标记CM22、CM01、CM12、CM13位于cry1Ab基因的一侧,与cry1Ab基因的遗传距离分别为4.6cM、4.2cM、3.1cM和2.7cM;微卫星标记CM24、CM10和RM1261位于另一侧,与cry1Ab的遗传距离分别为3.1cM、3.5cM和5.2cM。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 水稻白叶枯病研究进展及其抗病育种
• 1.1.1 水稻白叶枯病菌的研究
• 1.1.2 水稻白叶枯病的症状
• 1.1.3 水稻白叶枯病的流行特点
• 1.1.4 水稻白叶枯病的发生和分布
• 1.1.5 水稻白叶枯病的防治策略
• 1.1.6 水稻白叶枯病抗性研究及其利用
• 1.1.7 水稻白叶枯病抗性基因的研究及其利用
• 1.1.8 水稻白叶枯病抗病育种
• 1.2 Bt 基因及转Bt 基因作物的研究进展
• 1.2.1 苏云金芽孢杆菌（Bt）及其杀虫晶体蛋白
• 1.2.2 转Bt 基因作物的研究进展和商品化现状
• 1.2.3 害虫对Bt 作物抗性的产生及其对策
• 1.2.4 转入基因对作物农艺性状的影响
• 1.3 分子标记技术的研究和应用
• 1.3.1 DNA 分子标记的种类及概述
• 1.3.2 分子标记技术在育种中的应用
• 第二章 多抗性转基因水稻恢复系的培育
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 供试植物材料
• 2.1.2 实验方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 亲本及其杂种的抗性
• 2.2.2 抗虫、抗除草剂水稻恢复系T773-1 的育成
• 2.2.3 抗白叶枯病水稻恢复系T773-2 的育成
• 2.2.4 抗虫、抗除草剂、抗白叶枯病的多抗转基因水稻恢复系的育成
• 2.2.5 杂交后代的田间抗虫性表现
• 2.3 讨论
• 2.3.1 水稻抗病虫基因聚合育种的意义
• 2.3.2 分子标记辅助选择育种
• 2.3.3 转基因作物农艺性状的改良
• 第三章 水稻香味基因与抗白叶枯基因的分子标记聚合育种
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 水稻材料及选择标记
• 3.1.2 实验方法
• 3.2 结果与分析
• 2 代分离群体的分子标记辅助选择'>3.2.1 自交F₂代分离群体的分子标记辅助选择
• 3 代分离群体的分子标记辅助选择'>3.2.2 自交F₃代分离群体的分子标记辅助选择
• 4 代分离群体的分子标记辅助选择'>3.2.3 自交F₄代分离群体的分子标记辅助选择
• 3.3 讨论
• 第四章 cry1Ab 基因在转基因水稻中的分子标记定位研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 分离群体的表现型
• 4.2.2 Tail-PCR 法获得外源基因侧翼序列
• 4.2.3 微卫星标记的发展
• 4.2.4 SSR 标记引物的群体分析
• 4.2.5 标记基因型与抗性表现型的共分离
• 4.2.6 连锁分析
• 4.3 讨论
• 4.3.1 转cry1Ab 基因的定位
• 4.3.2 关于Tail-PCR 技术的应用
• 4.3.3 关于外源转基因的研究
• 参考文献
• 3-1 各单株的基因型结果'>附表Ⅰ分离群体F₃-1 各单株的基因型结果
• 致谢
• 攻读学位期间发表论文情况