论文摘要
目的胸腺素起初是在小牛胸腺组织中被鉴定的一类小分子蛋白家族,根据等电点的不同分为α、β、γ三类。其中β族胸腺素是一类高度保守的酸性小分子蛋白质,胸腺素β4（Thymosinβ4,Tβ4）和胸腺素β10（Thymosinβ10,Tβ10）在哺乳动物细胞中表达最为丰富,它们都能通过氨基酸序列中的保守区域“LKKTET”与G-actin结合,参与细胞骨架的形成,与细胞的运动能力密切相关。Tβ4还能通过“LKKTET”氨基酸序列发挥促进VEGF表达和血管形成作用。Tβ4和Tβ10在人体多种组织中表达,已经证实它们在许多肿瘤（如乳腺癌、卵巢癌、甲状腺癌、结肠癌、肾癌、黑色素瘤等）中表达明显高于其来源的正常组织,并与这些肿瘤的恶性程度呈正相关。然而近年来有学者在对Tβ10的研究中得到了相反的结论,认为Tβ10是一种肿瘤抑制因子。胸腺素β15（Thymosinβ15,Tβ15）最早是由Zetter等学者在高转移性大鼠前列腺癌Dunning细胞中发现的,Tβ15在许多正常组织中不表达。Tβ15 mRNA表达与大鼠的前列腺癌、小鼠肺癌、人类乳腺癌和恶性黑色素瘤细胞的转移潜能相关。Tβ15蛋白表达与人类乳腺癌侵袭能力有关。在人类肺癌中这两个分子的作用尚不清楚。本研究探讨Tβ10和Tβ15在肺癌中的表达,分析它们与各临床病理因素之间的关系,揭示Tβ10和Tβ15在肺癌细胞侵袭和转移过程中的作用机制。实验材料和方法1、69例原发性非小细胞肺癌癌组织及癌旁正常肺组织标本均来自1980年到2000年在中国辽宁省鞍山肿瘤医院实行手术的病人,患者术前均未接受放化疗。标本用中性福尔马林溶液固定,石蜡包埋,制成4μm切片,采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶免疫组化法（S-P法）检测组织中Tβ10、VEGF、VEGF-C蛋白表达情况,微血管密度（microvessel density,MVD）和淋巴管密度（lymphatic vesseldensity,LVD）。以PBS代替一抗作为阴性对照。结果判定:Tβ10、VEGF、VEGF-C以细胞质中出现棕黄色颗粒为阳性显色。光镜下每张切片选取癌细胞较多的10个高倍视野计数100个癌细胞中的阳性细胞数,Tβ10的评估为阳性细胞数≤50%为低表达,＞50%为高表达;VEGF、VEGF-C的评估为阳性细胞数≥10%为阳性表达,＜10%为阴性表达。血管和淋巴管判定标准为:内皮细胞形成条状、裂隙状等孤立结构棕黄染色或有管腔者按一条血管或淋巴管计数。低倍光镜下确定3个微血管或淋巴管高密度区域（热点）,然后在高倍镜下分别计数每个热点中3个区域的CD34染色（用于标记MVD）和D2-40（用于标记LVD）染色阳性管腔数均值。MVD=（CD34阳性管腔数-D2-40阳性管腔数）均值;LVD=D2-40阳性管腔数均值。当计数相差10%以上时则重新计数。分别用含10%新鲜胎牛血清的RPMI1640或DMEM培养基,在37℃、5%CO2的条件下培养PG-LH7人肺巨细胞癌PG的低转移亚系、PG-BE1人肺巨细胞癌PG的高转移亚系、人肺腺癌高转移细胞系A549。细胞爬片免疫组织化学染色:培养细胞制作细胞爬片,4%多聚甲醛室温固定15min,0.2%TritonX-100处理,采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶免疫组化法（S-P法）观察Tβ10蛋白表达情况。质粒构建和转染:用含Tβ10cDNA全长序列质粒pcDNA3.0-Tβ10及pcDNA3.0载体构建Tβ10cDNA反义重组质粒pcDNA3.0-as-Tβ10。稳定转染Tβ10高表达的人肺巨细胞癌PG细胞系的高转移潜能细胞亚系BE1细胞,具体转染步骤按脂质体LipofectAMINETM2000试剂说明书进行,含400μg/ml G418的RPMI1640筛选培养基培养转染细胞。以未转染的BE1细胞和转染空载体pcDNA3.0的细胞（称为BE1-EV）作为对照。RT-PCR方法用来检测各个细胞系中Tβ10 mRNA表达水平和BE1细胞转染前后Tβ4 mRNA和Tβ10 mRNA变化。取对数生长期用TRIZOL提取总RNA,逆转录成cDNA。扩增Tβ10、Tβ4,以β-actin为内参。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后成像分析。免疫荧光:观察转染前后Tβ4、Tβ10蛋白以及F-actin变化。培养细胞用4%多聚甲醛室温固定15min。Triton X-100处理,血清封闭后分别滴加Tβ10,Tβ4一抗,4℃孵育过夜。避光加FITC标记二抗和罗丹明（TRITC）-鬼笔环肽,Hoechst33342复染细胞核后,于倒置荧光显微镜下观察结果。Western blot:收集细胞提取总蛋白。采用考马斯亮蓝法进行蛋白定量。取等量蛋白,进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和转印,一抗（anti-VEGF 1:100稀释,anti-VEGF-C 1:200稀释,anti-ERK1/2 1:200稀释,anti-pERK 1:200稀释,anti-β-actin 1:200稀释）和各自对应的辣根过氧化物酶标记二抗（1:2500稀释）孵育后DAB显色,结果经自动电泳凝胶成像分析仪采集,进行灰度值测定。以β-actin为内对照,计算VEGF、VEGF-C、ERK1/2和pERK的相对表达量。MTT法检测细胞增殖:将单个细胞悬液接种于96孔培养板中,每孔含103个细胞,培养24h,每孔加入MTT（Methylthiazoluldiphenyl-tetrazolium bromide）溶液继续培养4h,加入DMSO,490nm波长下测定各孔光吸收值,以不含细胞的等体积培养基作对照。绘制细胞生长曲线。细胞迁移和侵袭能力检测:细胞迁移能力检测用无血清RPMI1640培养基重悬细胞,上室中加入2.5×104个细胞,下室加入含10%小牛血清RPMI1640培养基。37℃、5%CO2孵箱中培养6h,甲醇室温固定15min,用棉签轻擦掉上表面的细胞,苏木素染色。取下聚碳酸酯微孔膜,置载玻片上镜下观察。细胞侵袭能力的测定用预冷的无血清RPMI1640培养基1:3稀释Matrigel加入上室100μl,在室温下放置3h。使用前用培养基重新水化并吸净,其他与迁移实验相同,培养18h后观察结果。2、76例原发性非小细胞肺癌癌组织及癌旁正常肺组织标本均来自1980年到2000年在中国辽宁省鞍山肿瘤医院实行手术的病人,患者术前均未接受放化疗。标本用中性福尔马林溶液固定,石蜡包埋,制成4μm切片,经脱蜡,脱苯,水化后,采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶免疫组化法（S-P法）检测组织中Tβ15蛋白表达情况。结果判定:以细胞质中出现棕黄色颗粒为阳性显色,光镜下每张切片在诊断确实的肺癌组织中随机选取10个高倍视野,每个视野计数100个细胞。阳性染色细胞数≤50%为Tβ15低表达,＞50%为Tβ15高表达。细胞爬片免疫组织化学染色:培养细胞制作细胞爬片,4%多聚甲醛室温固定15min,0.2%TritonX-100处理,采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶免疫组化法（S-P法）观察Tβ15蛋白表达情况。用含10%新鲜胎牛血清的RPMI1640培养基,在37℃、5%CO2的条件下分别培养PG-LH7人肺巨细胞癌PG的低转移亚系、PG-BE1人肺巨细胞癌PG的高转移亚系。细胞转染:pEGFP-C1-Tβ15和pEGFP-C1质粒稳定转染Tβ15低表达的人肺巨细胞癌PG细胞系的低转移潜能细胞亚系LH7细胞,具体转染步骤按脂质体LipofectAMINETM2000试剂说明书进行,含400μg/ml G418的RPMI1640筛选培养基培养转染细胞。以未转染的LH7细胞和转染空载体pEGFP-C1的细胞（称为LH7-EV）作为对照。RT-PCR方法用来检测各个细胞系中Tβ15 mRNA表达水平和LH7细胞转染前后Tβ15 mRNA变化。步骤同Tβ10实验。细胞迁移能力检测:细胞迁移能力检测用无血清RPMI1640培养基重悬细胞,上室中加入2.5×104个细胞,下室加入含10%小牛血清RPMI1640培养基。37℃、5%CO2孵箱中培养24h,甲醇室温固定15min,用棉签轻擦掉上表面的细胞,苏木素染色。取下聚碳酸酯微孔膜,置载玻片上镜下观察。3、数据分析:使用SPSS13.0统计软件进行数据处理,以P＜0.05为有统计学意义。实验结果1、Tβ10、VEGF、VEGF-C在非小细胞肺癌中的表达及与临床病理因素的关系:69例肺癌细胞中均有Tβ10表达,表达主要定位于癌细胞胞质,阳性细胞数从20%-90%,其中50例（72.5%）为高表达,低表达者为19例（27.5%）。而癌旁正常组织中的肺泡上皮细胞、支气管上皮细胞为阴性表达。69例组织中VEGF、VEGF-C的阳性率为68.1%和52.2%,表达于癌细胞胞质内。Tβ10的高表达与VEGF（P=0.004）、VEGF-C（P=0.017）的表达呈正相关。Tβ10的表达水平与肺癌的分期呈正相关（P=0.026）,与淋巴结转移呈正相关（P=0.007）,与血行转移呈正相关（P=0.016）,与肺癌的分化程度呈负相关（P=0.03）。Tβ10、VEGF、VEGF-C的表达与MVD和LVD的关系:69例肺癌组织切片内平均MVD为38.65±14.31个,平均LVD为18.56±12.48个。Tβ10高表达组的MVD（43.85±10.03）和LVD（21.39±12.39）明显高于低表达组的MVD（24.98±15.09）和LVD（11.10±9.48）,差异显著（p＜0.01,p＜0.01）。VEGF阳性表达组的MVD（44.96±8.57）明显高于阴性表达组的MVD（25.17±14.92）（p＜0.01）。VEGF-C阳性表达组的LVD（24.67±11.54）高于阴性表达组的LVD（11.90±9.88）（P＜0.01）。MVD与血行转移呈正相关（P＜0.001）,与淋巴结转移无关（p=0.817）;淋巴管密度与淋巴结转移呈正相关（p=0.017）,与血行转移无关（p=0.079）。2、LH7、BE1和A549细胞均有Tβ10 mRNA和蛋白表达,但低转移细胞系LH7中的Tβ10 mRNA表达明显低于高转移细胞系BE1（P＜0.01）和A549（P＜0.01）;Tβ10蛋白表达定位于细胞质内,PG-LH7细胞呈浅棕黄色,为低表达,PG-BE1细胞和A549细胞均呈深棕黄色,为高表达。Tβ10高表达肺癌细胞系BE1细胞稳定转染Tβ10反义cDNA重组表达质粒pcDNA3.0-as-Tβ10后,经过筛选得到Tβ10表达受到明显抑制的细胞BEl-as-Tβ10,其mRNA相对表达量与BE1细胞相比明显减少（P＜0.05）。Tβ10表达降低的BEl-as-Tβ10细胞胞质中可见平行排列聚合的F-actin;转染了空载体的BE1细胞以及未做处理的BE1细胞胞质中看到弥漫散在的荧光信号,分布杂乱而模糊,难以见到清晰的微丝结构。BEl-as-Tβ10细胞VEGF、VEGF-C和pERK表达明显下调（P＜0.05,P＜0.05,P＜0.01）。3、MTT法测定结果显示,BE1-as-Tβ10细胞增殖能力明显低于空质粒转染组和空白对照组（P＜0.01,P＜0.01）。Transwell迁移实验显示,转染反义Tβ10细胞的细胞穿透数目（18±12.6）与空质粒转染组（48.4±9.1,P＜0.01）和空白对照组（41.2±14.9,P＜0.05）相比明显减少,差异有统计学意义。在细胞侵袭实验中BE1-as-Tβ10细胞穿透数目（7.8±3.6）与空质粒转染组（23.8±8.4,P＜0.01）和空白对照组（22.4±8.4,P＜0.01）相比明显减少,差异有统计学意义。4、76例肺癌组织中均有Tβ15表达,表达主要定位于癌细胞胞质,阳性细胞数从20%-90%,其中Tβ15蛋白高表达为51例（67.1%）,低表达者为25例（32.9%）。Tβ15在癌旁正常组织中的肺泡上皮细胞、支气管上皮细胞为阴性表达。Tβ15高表达与肺癌的分期（P=0.018）、不良分化（P=0.013）和淋巴结转移（P=0.001）正相关。5、LH7和BE1细胞均有Tβ15 mRNA和蛋白表达,低转移亚系LH7中的Tβ15mRNA表达明显低于高转移亚系BEl（P＜0.01）;Tβ15蛋白表达定位于细胞质内,低转移亚系PG-LH7细胞呈浅棕黄色,低表达;高转移亚系PG-BE1细胞呈深棕黄色,为高表达。Tβ15低表达肺癌细胞系LH7细胞转染pEGFP-C1-Tβ15后Tβ15mRNA含量显著增加（P＜0.01,P＜0.01）。在细胞迁移实验中pEGFP-C1-Tβ15转染组细胞穿透数目分别为:96.33±6.94和98±10.58,与空质粒转染组（46±8.89）和空白对照组（37±8.19）相比明显增加,差异有统计学意义（P=0.001,P=0.044,P=0.002,P=0.016）。结论1、Tβ10高表达与非小细胞肺癌的分期、淋巴结转移、血行转移,不良分化正相关,与VEGF、VEGF-C的表达正相关,Tβ10高表达组肿瘤中的MVD和LVD均明显高于低表达组,VEGF、VEGF-C的表达分别与MVD和LVD呈正相关。2、转染反义Tβ10 cDNA重组表达质粒,有效抑制BE1肺癌细胞的Tβ10表达水平后,细胞中出现F-actin,细胞增殖、迁移和侵袭能力降低,VEGF、VEGF-C和pERK表达减少。这可能与Tβ10能参与细胞骨架的形成,调节细胞运动并和ERK的磷酸化有关。3、Tβl5高表达与非小细胞肺癌的分期、不良分化和淋巴结转移正相关。4、向Tβ15低表达肺癌细胞PG-LH7内转染pEGFP-C1-Tβ15质粒,增加细胞的Tβ15表达水平后,细胞迁移能力增强。