论文摘要
目的:动物实验观察肢体缺血预处理（limb ischemic preconditioning , LIPC）对肝脏缺血再灌注（ischemia reperfusion,IR）损伤能否产生保护作用,为临床上减轻肝脏IR损伤探索一条新的途径,并通过观察凋亡抑制基因Bcl-2及核因子NF-κB在肝组织中的表达情况初步探讨IPC的保护机制。方法:40只SD（Sprague-Dawley）大鼠,体重227±12.6g,随机分为4组,每组10只,即假手术组（sham operation,SO）、缺血再灌注组（IR）、肝脏缺血预处理组（hepatic ischemic preconditioning,HIPC）、肢体缺血预处理组（limb ischemic preconditioning,LIPC）。（1） SO组:仅游离肝十二指肠韧带而不阻断,然后关腹。（2） IR组:小号无损伤血管夹夹闭肝十二指肠韧带致肝缺血30min,然后松开血管夹恢复灌注,关腹。（3） HIPC组:小号无损伤血管夹夹闭肝十二指肠韧带致肝缺血10min,再松开血管夹恢复灌注10min,如此反复3次共用时60min完成HIPC过程,以后操作同IR组。（4） LIPC组:游离双侧股动脉,两枚小号无损伤血管夹同时夹闭双侧股动脉致双后肢缺血10min,再松开血管夹恢复灌注10min,如此反复3次共用时60min完成LIPC过程,以后操作同IR组。各组大鼠于再灌注6h后再次麻醉,经心脏采血5ml,离心后取上层血清置于-70℃冰箱保存,待检测血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）水平。开腹取肝组织用4%中性多聚甲醛溶液及时固定,待做石蜡切片后行组织学检测。比较各组肝组织HE染色切片;免疫组化法检测Bcl-2、NF-κB p65表达水平并计算阳性细胞指数（positive index,PI）;脱氧核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated d-UTP nick end labeling, TUNEL）检测凋亡细胞并计算凋亡指数（apoptosis index,AI）。多组间均数差异性比较用单因素方差分析（one-way ANOVA）,两两比较用SNK-q检验。全部数据利用SPSS统计软件进行分析,以P<0.05为差异有统计学意义。结果:（1）SO组大鼠肝脏表面色泽光亮红润;IR组、HIPC组和LIPC组在阻断肝血流后,肝脏颜色变成暗红色,质地变软。再灌注6h后,HIPC组和LIPC组大鼠肝脏基本恢复红润;IR组可见明显的点状或片状的无复流区,质地变硬。（2）SO组、IR组、HIPC组和LIPC组血清ALT水平分别为52.95±6.95U/L、654.06±104.45U/L、395.52±38.18U/L、437.25±48.41U/L;血清AST水平分别为79.66±10.63 U/L、782.49±112.40U/L、431.75±40.89U/L、481.53±58.17U/L。IR组、HIPC组、LIPC组血清ALT、AST水平较SO组显著升高（P<0.05）。其中IR组升高最明显,与HIPC组、LIPC组比较差异有统计学意义（P<0.05）。HIPC组与LIPC组比较差异无统计学意义（P>0.05）。（3） SO组光镜下肝小叶结构轮廓清晰,肝细胞索完整,肝实质细胞结构正常、无水肿,肝血窦无明显瘀血,中性粒细胞散在;IR组见肝血窦和中央静脉有不同程度的瘀血,肝细胞严重气球样变性,胞浆疏松化,见大量空泡样改变,窦状内皮细胞明显肿胀,部分脱离基底膜,肝内胆管明显瘀胆,中性粒细胞浸润明显;HIPC及LIPC组肝组织结构与SO组相似,肝实质细胞轻度浊肿,见少量空泡样改变,窦状内皮细胞部分肿胀,少量脱离基底膜,汇管区无明显炎症细胞浸润。（4） SO组、IR组、HIPC组和LIPC组Bcl-2的PI分别为0.119±0.026、0.108±0.022、0.632±0.099、0.591±0.050。Bcl-2阳性表达在SO组、IR组较少,而在HIPC组和LIPC组表达明显,与SO组、IR组比较差异有统计学意义（P<0.05）。SO组与IR组比较差异无统计学意义（P>0.05）。HIPC组与LIPC组比较差异无统计学意义（P>0.05）。（5） SO组、IR组、HIPC组和LIPC组NF-κB p65的PI分别为0.093±0.025、0.402±0.046、0.635±0.079、0.583±0.047。NF-κB p65阳性表达在SO组较少,而在IR组、HIPC组和LIPC组表达明显,与SO组比较差异均有统计学意义（P<0.05）。其中HIPC组、LIPC组NF-κB p65阳性表达较IR组更高,与IR组比较差异有统计学意义（P<0.05）。HIPC组与LIPC组比较差异无统计学意义（P>0.05）。（6） SO组、IR组、HIPC组和LIPC组的AI（%）分别为0.92±0.16、9.64±1.57、4.94±0.42、5.02±0.44。凋亡细胞在SO组罕见,IR组、HIPC组和LIPC组都有明显增加。IR组、HIPC组、LIPC组AI与SO组比较差异均有统计学意义（P<0.05）。其中IR组AI增加最明显,与HIPC组、LIPC组比较差异有统计学意义（P<0.05）。HIPC组与LIPC组比较差异无统计学意义（P>0.05）。结论:（1）缺血预处理可以显著抑制缺血再灌注损伤导致的细胞胀亡和凋亡,从而减轻肝脏缺血再灌注损伤。（2）肢体缺血预处理与肝脏缺血预处理具有同样的保护肝脏、对抗缺血再灌注损伤的作用。肢体缺血预处理具有安全、有效、经济、便捷等优点。（3）缺血预处理的抗凋亡作用与上调凋亡抑制基因Bcl-2的蛋白表达有关。（4）核因子NF-κB的激活可能在缺血预处理的保护作用中起重要作用。