姬松茸多糖、亚硒酸钠对树突状细胞表型及功能成熟的影响

论文摘要

背景和目的姬松茸（Agaricus blazei Murill）,原产于巴西,是一种食药兼用的珍稀食用菌。1960年被研究员Takatoshi Furumoto发现并带到日本进行研究。子实体和纯系培养的菌丝体可以分离得到多种活性代谢产物如活性多糖、活性核酸、活性甾醇类及外源凝集素等。姬松茸多糖（Agaricus blazei polysaccharides,ABP）作为其主要有效成分,具有明显的抗癌活性、免疫调节和抗突变作用。硒（Se）是人体必需的微量元素,于1817年被瑞典学者Berzelius发现,具有广泛的生物学功能,特别是对多种肿瘤的生长具有抑制作用。树突状细胞（dendritic cell,DC）是目前已知的机体内功能最强的抗原提呈细胞（APC）,与其它APC相比,其最大的特点是能显著刺激初始型T细胞增殖,而其它APC仅能刺激己活化的或记忆性T细胞。因此DC是机体细胞免疫反应的始动者,在介导机体的免疫反应、抵御恶性肿瘤中发挥重要作用。机体的抗肿瘤免疫主要是T细胞介导的细胞免疫,而DC对T淋巴细胞的增殖分化有着重要的影响。DC作为一种高效的抗原提呈细胞可通过吞噬、胞饮和受体介导的方式摄取抗原,加工形成抗原肽-MHC分子复合物提呈给特异性T细胞,激活相应的CD4+辅助性T细胞（helper T lymphocyte,Th）和CD8+细胞毒性T细胞（cytotoxicT lymphocyte,CTL）。CD4+Th细胞在机体抗肿瘤过程中起重要作用,而且使宿主保留免疫记忆,对防止肿瘤复发具有重要意义。DC也可以直接激活CD8+CTL细胞,诱导CTL特异性杀伤作用。姬松茸多糖发挥抗癌作用的主要机制是对宿主的免疫系统产生影响,从而通过活化巨噬细胞、天然杀伤细胞、T淋巴细胞,诱发促进干扰素的产生等对肿瘤细胞直接或间接地发挥作用。硒的抗肿瘤作用机制包括降低致癌因子的诱变性、调节谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的抗癌活性、促进肿瘤细胞凋亡、对DNA损伤的预防和修复、调节机体的免疫功能等,然而姬松茸多糖、硒对树突状细胞的免疫调变效应鲜见报道。本实验通过体外试验研究姬松茸多糖、亚硒酸钠对树突状细胞表型和功能成熟的影响,进一步阐明姬松茸多糖、亚硒酸钠与DC相关的抗肿瘤机制,为临床应用提供理论依据。实验方法1.小鼠骨髓来源DO的体外培养:拉颈处死小鼠,冲洗出股骨和胫骨骨髓细胞,将红细胞裂解后用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液（10ng/ml rmGM-CSF,5ng/ml rmlL-4）培养。隔天半量换液。2.培养第3d,实验组在培养液中分别加入不同浓度（50μg/ml,100μg/ml,200μg/ml）的ABP溶液,亚硒酸钠溶液（0.02μg/ml）,设生理盐水对照组。3.第6d倒置显微镜观察DC形态变化,第8d通过流式细胞仪分析各组细胞表面分子CD86和CD11a的表达来评价ABP和亚硒酸钠对DC表型成熟的影响。4.第8d收集DC,流式细胞术检测DC的细胞周期来评价ABP和亚硒酸钠对DC增殖的影响。5.第8d收集各组经ABP和亚硒酸钠作用的DC作为刺激细胞,经丝裂霉素处理后,分别与小鼠脾脏来源的同种异体T淋巴细胞以1:50的比例混合培养96h后收获T细胞,流式细胞术检测T细胞DNA含量和细胞周期来判断T细胞增殖情况,评价ABP和亚硒酸钠对DC致敏的T细胞增殖的影响。6.各组DC培养至第3d,负载H22肿瘤抗原肽,实验组在培养液中分别加入不同浓度的ABP溶液,亚硒酸钠溶液,第8d收集DC,分别与小鼠脾脏来源的T淋巴细胞混合培养48h后收集T淋巴细胞,与小鼠肝癌腹水瘤细胞（H22）混合培养28h,MTT法检测DC诱导的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）对H22肝癌细胞的杀伤活性。7.用统计学软件包SPSS13.0进行统计学分析,结果用x±s表示,多个样本均数之间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA）,显著性水准为P＜0.05。实验结果1.DC培养至第6d,倒置显微镜下观察,对照组可见大部分细胞有树突样突起,呈现出典型的非成熟树突状细胞的形态特征;加入ABP（50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml）或ABP（100μg/ml）+亚硒酸钠（0.02μg/ml）继续培养至第6d,发现大部分树突状细胞突起减少,细胞变大变圆,呈现出典型成熟树突状细胞的形态;亚硒酸钠（0.02μg/ml）组细胞生长缓慢,突起不明显,细胞密度也相对较小。2.体外加入不同浓度的ABP（50μg/ml,100μg/ml,200μg/ml）后,DC表达高水平共刺激分子CD86、CD11a（加药组与NS组相比,差异有统计学意义,P＜0.05）;亚硒酸钠（0.02μg/ml）组DC表面标志CD86、CD11a的表达下调;ABP（100μg/ml）+亚硒酸钠（0.02μg/ml）组DC表面标志CD86、CD11a的表达显著升高（与其它组相比,差异均有统计学意义,P＜0.05）。3.ABP（100μg/ml）组DC增殖指数升高（与NS组相比,差异有统计学意义,P＜0.05）;亚硒酸钠（0.02μg/ml）组DC增殖指数无明显变化（P＞0.05）,ABP（100μg/ml）+亚硒酸钠（0.02μg/ml）组DC增殖指数降低。4.ABP（50μg/ml,100μg/ml）组T淋巴细胞增殖指数增高(与NS组相比,差异具有统计学意义（P＜0.05）;亚硒酸钠（0.02μg/ml）组T淋巴细胞增殖指数降低（P＜0.05）;ABP（100μg/ml）+亚硒酸钠（0.02μg/ml）组T淋巴细胞增殖指数明显升高（与其它各组相比,差异均有统计学意义,P＜0.05）。5.MTT法检测DC诱导的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）对H22肝癌细胞的杀伤活性,ABP（50μg/ml,100μg/ml,200μg/ml）组杀伤率均升高（与对照组相比,差异有统计学意义,P＜0.05）;亚硒酸钠（0.02μg/ml）组杀伤率亦升高（P＜0.05）;ABP（100μg/ml）+亚硒酸钠（0.02μg/ml）组杀伤率无明显变化（P＞0.05）。实验结论1.ABP促进体外培养的DC分化成熟,提高表面共刺激分子CD86,CD11a的表达;亚硒酸钠抑制树突状细胞表面共刺激分子CD86,CD11a的表达;但亚硒酸钠增强ABP对DC的促分化成熟作用。2.ABP促进体外培养的DC的增殖;亚硒酸钠减弱ABP对DC的促增殖作用。3.ABP促进DC致敏的T淋巴细胞增殖:亚硒酸钠增强ABP对DC致敏的T细胞的促增殖作用。4.ABP、亚硒酸钠均提高T细胞转化的CTL特异性肿瘤杀伤能力,两者共同存在时亚硒酸钠减弱了ABP的作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 论文部分 姬松茸多糖、亚硒酸钠对树突状细胞表型及功能成熟的影响
• 引言
• 材料和方法
• 实验结果
• 附图
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 综述 姬松茸多糖、亚硒酸钠的抗肿瘤作用研究进展
• 参考文献
• 缩略语
• 致谢