栉孔扇贝（Chlamys farreri）Toll样受体及其信号传递相关基因的克隆与表达

论文摘要

扇贝是我国海水养殖的重要品种,但自1994年以来,养殖扇贝陆续爆发的大规模死亡,不但造成了巨大的经济损失,而且直接威胁到现有产业的生存和发展。引起扇贝大规模死亡原因是多方面的,其主要原因是养殖环境恶化、扇贝种质衰退和抗病力下降。因此,深入研究扇贝免疫防御机制,探讨提高机体抗病力的有效途径和方法,改良种质和培育抗病品系,无疑是解决目前困扰扇贝养殖业健康可持续发展的必经之路。Toll样受体（TLRs）家族是新近发现的模式识别受体（PRRs）,参与识别病原体相关的分子模式（PAMPs）,在天然免疫系统中起着非常重要的作用。哺乳动物中Toll样受体信号通路还参与诱导树枝状细胞成熟、参与免疫耐受、参与凋亡发生发展、介导非感染性因素的识别等,被视为联系天然免疫和获得性免疫的桥梁。同时果蝇的Toll信号通路也是不具备获得性免疫的果蝇赖以抵御病毒、细菌和真菌感染,介导天然免疫反应的重要信号通路。本研究采用大规模EST测序方法,结合Genome Walker库的构建和cDNA末端快速扩增技术,从栉孔扇贝克隆得到CfToll-1、CfMyd88、CfTRAF6和CfCactus这四个Toll样受体信号通路基因的全长cDNA,同时用荧光实时定量PCR技术检测了这些基因的组织分布及在脂多糖（LPS）和肽聚糖（PGN）刺激下的表达规律。栉孔扇贝Toll样受体（CfToll-1）的cDNA序列全长4308 bp,包含5’非翻译区（UTR）211 bp,3597 bp的开放阅读框,500 bp的3’UTR,最后为18个腺嘌呤的ploy A尾巴。开放阅读框编码1198个氨基酸的多肽,该多肽的估计分子量为137.41kd,估计的等电点为5.62,该多肽有信号肽,具有一个预测的跨膜区,因此是一种跨膜蛋白。经BLAST比对,CfToll-1基因与节肢动物多种Toll蛋白高度的相似性。SMART（Simple Modular Architecture Research Tool）软件分析,CfToll-1包含典型的Toll样受体的结构:富含亮氨酸的重复序列的胞外区（leucine-richrepeats, LRR）,一段跨膜结构域,以及胞内区的TIR结构域（Toll/IL-1 receptorhomologous region）。利用Real-time RT-PCR发现CfToll-1mRNA在扇贝体内普遍存在于血细胞、肌肉、外套膜、心、性腺和鳃组织中。利用体外培养的原代血细

论文目录

• 图表目录
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一章 文献综述
• 第一节 天然免疫系统
• 1.1 免疫系统概述
• 1.1.1 获得性免疫系统
• 1.1.2 天然免疫系统
• 1.1.3 天然免疫系统的重要地位
• 1.2 无脊椎动物的天然免疫系统
• 1.2.1 天然免疫系统的识别策略
• 1.2.1.1 模式识别作用
• 1.2.1.2 模式识别受体
• 1.2.1.3 模式识别的免疫生物学意义
• 1.2.2 免疫信号的调整和放大
• 1.2.3 贝类主要免疫反应
• 第二节 Toll样受体研究进展
• 2.1 Toll 样受体的发现、结构和分布
• 2.2 Toll 样受体的模式识别
• 2.2.1 细菌的表面结构
• 2.2.2 细菌的鞭毛
• 2.2.3 真菌多糖成分
• 2.2.4 未甲基化的微生物DNA
• 2.2.5 人工合成的咪唑喹啉样分子
• 2.2.6 内源性的配体
• 2.3 Toll 样受体介导的免疫功能
• 2.3.1 促进细胞因子的合成与释放,引发炎症反应
• 2.3.2 抗病毒感染
• 2.3.3 诱导杀菌活性
• 2.3.4 ·诱导凋亡
• 2.3.5 Toll 样受体:天然免疫和获得性免疫的桥梁
• 2.3.5.1 Toll 样受体在启动获得性免疫中的作用
• 2.3.5.2 Toll 样受体对获得性免疫应答类型的调控
• 2.3.6 Toll 样受体间的协同作用
• 2.4 Toll 样受体:免疫治疗的新靶位
• 2.4.1 不同Toll 样受体靶位的应用价值
• 2.4.2 不同疾病中Toll 样受体靶位的治疗价值
• 2.4.2.1 炎症感染性疾病
• 2.4.2.2 变态反应性疾病
• 2.4.2.3 其他疾病
• 2.5 Toll 样受体在海水养殖中应用的探讨
• 第三节Toll 样受体信号传导途径的研究进展
• 3.1 Toll 样受体的信号传导机制
• 3.1.1 Myd88 依赖途径
• 3.1.2 Myd88 非依赖途径
• 3.2 Toll 样受体的信号传导途径的负性调节
• 3.3 果蝇Toll信号传导途径
• 3.4 海洋无脊椎动物Toll 样受体信号通路研究进展
• 第四节 研究的目的和意义
• 4.1 研究的目的
• 4.2 研究的意义
• 第二章 实验材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验动物
• 2.1.2 栉孔扇贝血细胞原代培养
• 2.1.3 实验所用主要试剂、仪器及设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 栉孔扇贝cDNA 文库的构建及序列分析
• 2.2.2 总RNA 的提取及第一链cDNA 的合成
• 2.2.3 基因片段的克隆
• 2.2.4 Genome Walker
• 2.2.5 5’-RACE
• 2.2.6 序列分析
• 2.2.7 Realtime RT-PCR（SYBR Green I 法）
• 第三章 实验结果和讨论—栉孔扇贝Toll样受体及其信号传递相关基因的克隆与表达
• 3.1 研究背景
• 3.2 实验结果
• 3.2.1 栉孔扇贝Toll 样受体基因（CfToll-1）的克隆与表达
• 3.2.1.1 栉孔扇贝cDNA 文库查找结果
• 3.2.1.2 六个同源片段的克隆与初步分析
• 3.2.1.3 栉孔扇贝CfToll-1 基因5’末端的克隆
• 3.2.1.4 栉孔扇贝CfToll-1 核苷酸序列分析
• 3.2.1.5 栉孔扇贝CfToll-1 二级结构预测
• 3.2.1.6 栉孔扇贝CfToll-1的同源性分析
• 3.2.1.7 Toll样受体相关蛋白的系统发生
• 3.2.1.8 栉孔扇贝CfToll-1mRNA 的组织表达
• 3.2.1.9 LPS对CfToll-1mRNA表达量的影响
• 3.2.2 栉孔扇贝Myd88基因（CfMyd88）的克隆与表达
• 3.2.2.1 栉孔扇贝CfMyd88基因的全长cDNA克隆
• 3.2.2.2 栉孔扇贝CfMyd88基因的核苷酸序列分析
• 3.2.2.3 栉孔扇贝CfMyd88基因的氨基酸序列分析
• 3.2.2.4 栉孔扇贝CfMyd88二级结构预测
• 3.2.2.5 栉孔扇贝CfMyd88基因的同源性分析
• 3.2.2.6 PGN对CfTMyd88 mRNA表达量的影响
• 3.2.3 栉孔扇贝TRAF6基因（CfTRAF6）的克隆与表达
• 3.2.3.1 栉孔扇贝CfTRAF6 基因的全长cDNA 克隆
• 3.2.3.2 栉孔扇贝CfTRAF6 基因的核苷酸序列分析
• 3.2.3.3 栉孔扇贝CfTRAF6 基因的氨基酸序列分析
• 3.2.3.4 栉孔扇贝CfTRAF6二级结构预测
• 3.2.3.5 栉孔扇贝CfTRAF6基因的同源性分析
• 3.2.3.6 TRAF蛋白家族的系统进化关系
• 3.2.3.7 栉孔扇贝CfTRAF6mRNA的组织表达
• 3.2.3.8 PGN对CfTRAF6mRNA表达量的影响
• 3.2.4 栉孔扇贝Cactus基因（CfCactus）的克隆与表达
• 3.2.4.1 栉孔扇贝CfCactus 基因的全长cDNA 克隆
• 3.2.4.2 栉孔扇贝CfCactus基因的核苷酸序列分析
• 3.2.4.3 栉孔扇贝CfCactus基因的氨基酸序列分析
• 3.2.4.4 栉孔扇贝CfCactus 二级结构预测
• 3.2.4.5 栉孔扇贝CfCactus基因的同源性分析
• 3.2.4.6 栉孔扇贝CfCactus mRNA 的表达研究
• 3.3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 发表文章目录
• 致谢