番石榴叶有效部位总皂苷抗轮状病毒性腹泻的相关实验研究

论文摘要

轮状病毒（Rotavirus,RV）是病毒性腹泻最常见的病原体,其所致的腹泻的发病率和严重程度居秋冬季腹泻的首位。人群对于轮状病毒普遍易感,且感染后免疫力短暂,因此轮状病毒性腹泻遍布世界各地,感染年龄较广泛,从新生儿、成年人至老年人都见有发病,尤其多见于5岁以下的小儿。近年来,各国科学工作者还不断发现RV可在中枢神经系统、呼吸系统等全身多系统发病,RV存在宫内感染的可能性也已被提出。轮状病毒是世界范围内引起婴幼儿严重腹泻的最主要原因,已成为严重的公共卫生问题,无论在发达国家和发展中国家都会造成不可忽视的发病率和死亡率,已经给患儿、家庭及社会都带来很大的影响。目前,病毒性腹泻尚无特异的抗病毒药物,而中医药呈现出独特的优势。番石榴叶治疗病毒性腹泻疗效确切。我们已经完成的番石榴叶单味药治疗病毒性腹泻的临床研究表明,番石榴叶对轮状病毒性肠炎疗效显著。体外实验亦证实番石榴叶及其有效成分能提高MA-104细胞对轮状病毒的耐受,降低其毒力,破坏轮状病毒颗粒的外壳和内核。我们在较早期的研究中侧重于有效单体的提取,但单纯的提取单体可能导致失去中药治病的某些有效成分,也忽略了中医药多靶点、多层次治疗疾病的特点。因此研究番石榴叶抗病毒性腹泻的有效部位可能更有意义。中药有效部位,是指当一味中药或复方中药提取物中的一类或几类化学成分的含量达到总提取物的50%以上,而且这一类或几类已知化学成分被认为是有效成分,该一类或几类成分的混合体即被认为是有效部位。中药有效部位治疗疾病可能从多方面发挥作用,更符合中医理论。因此我们拟对番石榴叶有效部位进行提取,并进行药效学实验。本实验主要分为三部分:第一部分通过大孔吸附树脂技术基本原理,提取番石榴叶有效部位总皂苷,使其含量达到55.3%;第二部分观测总皂苷对小鼠轮状病毒性腹泻的干预效果,根据粪Na～+、粪糖、粪SIgA、粪轮状病毒抗原转阴率等确定其疗效;第三部分通过检测各组小鼠经治疗后血清中的细胞因子IL-2、TNF-α的水平,并进行比较,探讨部分免疫机制。第一章大孔吸附树脂纯化番石榴叶有效部位总皂苷的工艺研究目的:提取番石榴叶有效部位总皂苷。方法:本实验主要根据大孔吸附树脂技术基本原理。首先单纯利用70%的乙醇回流提取番石榴叶粗粉2次,水浴挥干得浸膏中皂苷的含量为28.1%。然后利用大孔吸附树脂进行处理,通过其富集、纯化的过程进一步提高总皂苷的含量。首先预处理大孔树脂,再进行工艺条件及参数的考察优化,最后确定吸附容量、洗脱溶媒、洗脱溶媒的用量等。结果:1、吸附容量:10g SA-1大孔吸附树脂吸附30ml供试品溶液,可以吸附番石榴叶总皂苷393.79mg,吸附率可达到86.7%。2、洗脱溶媒:实验发现3BV的蒸馏水可以充分洗去大分子糖类等水溶性杂质。当用不同浓度的乙醇洗脱皂苷时,低浓度的乙醇也能洗脱出一定量的番石榴叶总皂苷,并随浓度的增大而增大。番石榴叶总皂苷主要集中在80%醇洗脱液中。3、洗脱溶媒的用量:80%乙醇洗脱液前4个柱体积洗脱浸膏占94.9%,皂苷占96.1%,故确定80%的乙醇洗脱液用量为4BV。结论:番石榴叶经2次70%的乙醇提后所得浸膏中皂苷含量为28.1%,经SA-1大孔树脂吸附纯化后,所得浸膏中皂苷含量可达55.3%。确定了以3BV的蒸馏水为去杂的溶媒,4BV的80%的乙醇为洗脱溶媒的方法。第二章番石榴叶有效部位总皂苷治疗小鼠轮状病毒性腹泻的药效学研究目的:制作小鼠轮状病毒性腹泻感染的模型,通过总皂苷对轮状病毒性腹泻小鼠的干预,根据小鼠一般表现、粪Na～+、粪糖、粪SIgA及轮状病毒抗原转阴率相应指标确定其疗效。方法:84只SPF级BALB-C小鼠随机分为皂苷高剂量组、皂苷中剂量组、皂苷低剂量组、感染对照组、思密达组、番石榴叶水煎剂组及正常对照组,每组12只。先取所有小鼠的粪便用A群轮状病毒诊断试剂盒检测均为阴性。除正常组外的每组小鼠给予浓度为10～4TCID50轮状病毒悬液100ul灌胃,24小时后收集所有小鼠的粪便用A群轮状病毒诊断试剂盒检测轮状病毒抗原,均为阳性,正常对照组给予等容量的生理盐水灌胃。感染后24小时,皂苷高、中、低剂量组、思密达组、番石榴叶水煎剂组分别给予相应剂量配置的药物0.5ml灌胃,正常对照组和感染组给予等容量的生理盐水灌胃,每天1次,疗程72h。在治疗过程中,密切观察各组小鼠的排便情况、精神、饮食、毛发、活动等。72h后,收集每只小鼠的粪便。摘眼球取血处死小鼠,同时迅速取出小肠组织,置于10%福尔马林溶液中固定。血液离心得血清保存。Na+浓度用生化仪上的电极法测定,葡萄糖浓度以氧化酶法测定,用放射免疫分析方法（RIA）检测SIgA含量,大便轮状病毒抗原用胶体金法检测。小肠组织脱水、包埋,修块,切片,染色,封片,于倒置显微镜下观察。统计学方法:使用SPSS13.0软件进行统计分析。各组粪钠、粪SIgA水平采用One-wayANOVA进行显著性分析,结果以均数士标准差（（?）±s）表示。粪糖采用KIndependent Samples Test进行显著性分析,结果以均数士标准差（（?）±s）及平均秩次表示。各组轮状病毒抗原转阴率采用K Independent Samples Test进行显著性分析,结果以平均秩次表示。当P≤0.05时存在统计学差异。结果:1、一般情况:与感染组比较,皂苷高、中剂量组小鼠的腹泻症状明显好转,与阳性药思密达组、番石榴叶水煎剂组相比,小鼠一般情况无显著差别。2、粪Na+水平:皂苷高、中、低剂量组、思密达组、番石榴叶水煎剂组粪Na+水平明显降低,与感染组相比有统计学意义（P<0.01）;皂苷低剂量组粪Na+水平高于其他5组,有统计学意义（P<0.05）;其他4组与正常组比较无明显差异（P>0.05）;皂苷高、中剂量组与思密达组、番石榴叶水煎剂组相比无统计学意义（P>0.05）。3、粪糖水平:皂苷高、中、低剂量组、思密达组、番石榴叶水煎剂组、正常组粪糖水平明显降低,与感染组相比差异有统计学意义（P<0.01）。在降低轮状病毒性腹泻小鼠粪糖水平上,思密达组疗效最佳,其次为皂苷高剂量组,番石榴叶水煎剂组,皂苷中剂量组,最后是皂苷低剂量组。4、粪SIgA水平:感染组粪SIgA水平高于正常组,差异具有统计学意义（P<0.05）;皂苷高、中剂量组、思密达组、番石榴叶水煎剂组粪SIgA水平增高,与感染组相比差异有统计学意义（P<0.01）;皂苷低剂量组低于其他5组,差异具有统计学意义（P<0.01）;皂苷高剂量组高于思密达组,两者比较差异具有统计学意义（P<0.01）;皂苷低剂量组与感染组相比差异无统计学意义（P>0.05）。5、粪轮状病毒抗原转阴率:治疗72h以后,检测各组小鼠粪便中的轮状病毒抗原,观察转阴率,结果示:皂苷高剂量组转阴9只（转阴率为75%）,中剂量组转阴9只（转阴率为75%）,低剂量组转阴7只（转阴率为58.3%）,感染组全部阳性（转阴率为0）,思密达组转阴7只（转阴率为58.3%）,番石榴叶水煎剂组转阴8只（转阴率为66.7%）。各组的转阴率差异具有显著性统计学意义（P=0.000）。6、小肠病理切片结果:番石榴叶有效部位总皂苷高、中剂量能有效改善轮状病毒性腹泻小鼠的小肠粘膜病变,对小肠粘膜具有保护作用。结论:番石榴叶有效部位总皂苷能有效治疗小鼠轮状病毒性腹泻。第三章番石榴叶有效部位总皂苷对轮状病毒性腹泻小鼠血清IL-2、TNF-α的影响目的:观察番石榴叶有效部位总皂苷对轮状病毒性腹泻小鼠血清IL-2、TNF-α水平的影响,初步探讨其作用机制。方法:84只SPF级BALB-C小鼠随机分为皂苷高剂量组、皂苷中剂量组、皂苷低剂量组、感染对照组、思密达组、番石榴叶水煎剂组及正常对照组,每组12只。先取所有小鼠的粪便用A群轮状病毒诊断试剂盒检测均为阴性。除正常组外的每组小鼠给予浓度为10～4TCID50轮状病毒悬液100ul灌胃,24小时后收集所有小鼠的粪便用A群轮状病毒诊断试剂盒检测轮状病毒抗原,均为阳性,正常对照组给予等容量的生理盐水灌胃。感染后24小时,皂苷高、中、低剂量组、思密达组、番石榴叶水煎剂组分别给予相应剂量配置的药物0.5ml灌胃,正常对照组和感染组给予等容量的生理盐水灌胃,每天1次,疗程72h。72h后,摘眼球取血处死小鼠,血液离心得血清保存。125ⅠIL-2放射免疫分析药盒及125ⅠTNF-α放射免疫分析检测小鼠血清中IL-2、TNF-α水平。统计学方法:使用SPSS13.0软件进行数据分析。各组血清IL-2、TNF-α水平采用One-way ANOVA分析,结果以均数士标准差（（?）±s）表示。当P<0.05时,存在统计学差异。结果:1、血清IL-2:皂苷高、中剂量与番石榴叶水煎剂组血清IL-2水平均明显高于感染组,差异有统计学意义（P<0.01）;皂苷高、中剂量与番石榴叶水煎剂组血清IL-2水平比较差异无统计学意义（P>0.05）;皂苷低剂量组、思密达组和正常组与感染组比较差异无统计学意义（P>0.05）。2、血清TNF-α:感染组血清TNF-α水平较正常组增高,具有统计学意义（P<0.01）;皂苷高、中、低剂量组、思密达组、番石榴叶水煎剂组与感染组比较差异具有统计学意义（P<0.01）。皂苷高、中剂量组、思密达组、番石榴叶水煎剂组与正常组比较,差异无统计学意义（P>0.05）;皂苷高、中剂量与番石榴叶水煎剂组相比差异无统计学意义（P>0.05）;皂苷低剂量组与水煎剂组比较差异具有统计学意义（P<0.01）。结论:总皂苷可能通过调节轮状病毒性腹泻小鼠血清中细胞因子IL-2、TNF-α的水平,间接发挥抗病毒作用。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 1、轮状病毒的病原生物学与分子生物学特征
• 2、轮状病毒的流行病学研究
• 3、轮状病毒的致病机制
• 4、轮状病毒的免疫学概况
• 5、轮状病毒感染模型的现状
• 6、祖国医学对病毒性腹泻的认识
• 7、番石榴叶治疗病毒性腹泻的优势
• 8、番石榴叶有效部位总皂营提取的意义
• 9、本课题的研究思路
• 第一章 大孔吸附树脂纯化番石榴叶有效部位总皂苷的工艺研究
• 1 材料
• 2 方法
• 3 实验结果
• 3.1 第附容量
• 3.2 洗脱溶媒
• 3.3 洗脱溶媒用量
• 4 讨论
• 4.1 大孔吸附树脂的研究背景
• 4.2 番石榴叶有效部位总皂苷的药理作用
• 4.3 SA-1型大孔吸附树脂对番石榴叶有效部位总皂苷提取的意义
• 第二章 番石榴叶有效部位总皂苷治疗轮状病毒性腹泻小鼠的药效学研究
• 1 材料
• 2 方法
• 3 实验结果
• 3.1 一般情况
• 3.2 治疗后各组小鼠粪Na～+、粪糖水平
• 3.3 治疗后各组小鼠SIgA水平
• 3.4 治疗后各组小鼠的轮状病毒抗原转阴率
• 3.5 小肠病理切片的结果
• 4 讨论
• 第三章 番石榴叶有效部位总皂苷对轮状病毒性腹泻小鼠血清IL-2、TNF-α的影响
• 1 材料
• 2 方法
• 3 实验结果
• 3.1 IL-2
• 3.2 TNF-α
• 4 讨论
• 4.1 IL-2与小鼠轮状病毒性腹泻
• 4.2 TNF-α与小鼠轮状病毒性腹泻
• 参考文献
• 全文小结
• 综述
• 附图
• 成果
• 致谢
• 研究生毕业论文统计学审稿证明