条斑紫菜原生质体转基因的研究

论文摘要

紫菜养殖业是我国海藻养殖业的支柱产业之一,也是主要的出口创汇海产品。近年来,随着紫菜栽培业规模的逐年扩大,对紫菜优良品种的供应要求越来越高。紫菜易于养殖,藻体形态结构简单,细胞发育分化易于调控,酶解紫菜产生原生质体及原生质体的再生技术已经成熟,易于进行分子水平上的研究。因此,开展紫菜基因工程研究,利用现代分子生物学的手段培育紫菜新品种是十分必要的,也具备现实可行性。同时,也有望将紫菜作为生物反应器来生产有用的外源蛋白。但是,目前紫菜的转基因研究还处于起始阶段,主要是应用高等植物中常用的启动子如CaMV 35S等研究报告基因在紫菜中的瞬间表达。因此,本论文以条斑紫菜（Porphyra yezoensis）的营养体纯系PY-qingdao1为材料,选择条斑紫菜的内源β-微管蛋白（tubulin）基因的侧翼序列为调控序列,通过微管蛋白基因及侧翼序列的克隆和分析、表达载体的构建、基因转化方法的建立等系统地进行了转基因研究,初步建立其转基因体系。在本论文的前期研究中,我们选取青岛地区野生条斑紫菜,利用酶解制备原生质体进行再培养的方法培育了营养体纯系PY-qingdao l。根据真核细胞β-微管蛋白序列进行比对结果,设计简并引物,采用针对高GC含量模板的PCR体系,从条斑紫菜PY Qingdao-l的基因组DNA中扩增出969bp的β-微管蛋白基因的部分序列,根据序列测定分析结果,设计反向PCR引物,并选用一系列在已知序列中不存在的识别位点的限制型内切酶对于条斑紫菜基因组DNA进行酶切,然后自连,以此为模板,进行反向PCR,克隆反向PCR片段并测序,序列拼接后共得到2799bp,提交到Genbank（AY221630）。其中编码区1377bp,GC含量60.57%,比报道过的一些红藻的β-微管蛋白基因编码区GC含量高,共编码458个氨基酸,没有内含子,表现出很强的密码子偏好性。其上游664bp序列GC含量高达66.42%,未发现TATA box, CAAT box等上游调控序列。其下游758bp的序列中没有典型的AAUAAA polyA信号,只存在一个CAYTG的高等植物下游的保守序列。将推测的蛋白质全序列与Genbank中其他真核细胞的β-微管蛋白进行序列分析,构建进化树,结果表明条斑紫菜与其他红藻和真菌聚为一个簇群,而不与包括绿藻在内的绿色植物构成一个簇群。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 藻类基因工程的研究进展
• 1.1 表达载体的构建
• 1.2 基因转化方法
• 1.3 藻类组织培养技术
• 1.4 转基因藻体的鉴定
• 2. 有关紫菜转基因的研究
• 2.1 紫菜的生物学特性
• 2.2 紫菜转基因研究进展
• 3. 农杆菌介导的基因转化的研究进展
• 3.1 农杆菌的生物学特性及宿主范围
• 3.2 农杆菌介导遗传转化的原理
• 3.3 农杆菌介导转化的方法
• 3.4 影响转化的因素
• 第二章 条斑紫菜的β－微管蛋白基因全长及侧翼序列的克隆
• 1. 材料
• 2. 方法
• 2.1 紫菜基因组 DNA 的提取
• 2.2 微管蛋白β-tubulin 部分序列的 PCR 扩增
• 2.3 pBluescript II KS 质粒 DNA 的小量提取
• 2.4 T-vector 的制备
• 2.5 PCR 产物与pKS T-vector 的连接
• 2.6 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
• 2.7 阳性克隆的筛选及序列测定
• 2.8 反向 PCR 扩增微管蛋白基因全序列及其侧翼序列
• 2.9 序列分析与进化树的构建
• 3. 结果
• 3.1 微管蛋白基因的简并 PCR 和反向 PCR 的电泳分析
• 3.2 微管蛋白基因的全序列及其侧翼序列
• 3.3 微管蛋白的系统进化树的建立
• 4. 讨论
• 第三章 β－微管蛋白基因侧翼序列控制下条斑紫菜原生质体瞬间表达的研究
• 1 材料
• 2 方法
• 2.1 紫菜原生质体的制备
• 2.2 条斑紫菜5’和3’非翻译区的 PCR 扩增
• 2.3 表达载体的构建
• 2.4 用于瞬间表达研究的质粒载体的纯化
• 2.5 电击转化紫菜原生质体
• 2.6 GUS 活性的定量检测
• 3. 结果
• 3.1 条斑紫菜微管蛋白基因5’和3’调控序列的扩增和克隆
• 3.2 瞬间表达载体pATubGUS 的构建
• 3.3 瞬间表达载体pBITu65L、pBITu65M 和pBITu655 的鉴定
• 3.4 瞬间表达载体pUCTubGUS 和pUCTubGU53L 的鉴定
• 3.5 瞬间表达载体的pATubGUS 的瞬间表达的研究
• 3.6 载体pBITu65L、pBITu65M 和pBITu655、p81221 的瞬间表达水平的比较
• 3.7 载体pBITu65L、pUCTubGU535 和pUCTubGUSL 的瞬间表达水平的比较
• 3.8 载体 pBITub5L、pUCTubGUS3S 和 pUCTubGUSL 的瞬时表达水平的 比较（不同长度 3’调控序列的转录终止活性）
• 4. 讨论
• 第四章 农杆菌介导的条斑紫菜原生质体瞬间表达的研究
• 1. 材料
• 2. 方法
• 2.1 表达载体的构建
• 2.2 农杆菌 EHA105 的转化
• 2.3 农杆菌介导的条斑紫菜原生质体瞬间表达
• 2.4 CAT 活性的检测
• 2.5 GUS活性的检测
• 3. 结果
• 3.1 大肠杆菌载体pATubCAT-H 的构建及其酶切鉴定
• 3.2 双元表达载体pCAMBIA 1302TubCAT 的构建及其酶切鉴定
• 3.3 双元表达载体pCAMBIA 3301Tub5L 的构建及其酶切鉴定
• 3.4 农杆菌介导的条斑紫菜原生质体瞬间表达的研究
• 4. 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢