两种天然倍半萜的抗肿瘤活性及其生合成中酶的基因克隆

论文摘要

抱茎苦荬菜[Crepidiastrum sonchifolium（Bunge）]是菊科苦荬菜属植物，盛产于我国东北、华北。其化学成分复杂多样，其中的倍半萜内酯类化合物有显著的生物活性。 本文利用大孔吸附树脂柱层析、硅胶柱层析等方法从抱茎苦荬菜中分离出含有两个活性倍半萜内酯苷成分的组合物并应用制备高效液相色谱，最终得到两个单一成分的化合物。利用光谱分析对二者进行结构鉴定，认定其分别为1（10），3，11（13）-愈创木三烯-12，6-内酯-2-酮-3-O-吡喃葡萄糖苷（苷1）和1（10），3-愈创木二烯-12，6-内酯-2-酮-3-O-吡喃葡萄糖苷（苷2）。 在活性内酯苷组合物的基础上，将葡萄糖基水解掉，成为内酯苷元组合物，再通过乙酸乙酯萃取，氧化铝柱层析等方法将组合物分离，分别得到两个苷元的单体。利用光谱分析对二者进行结构鉴定，认定其分别为3-羟基-1（10），3，11（13）-愈创木三烯-12，6-内酯-2-酮（苷元1）和3-羟基-1（10），3-愈创木二烯-12，6-内酯-2-酮（苷元2）。 将分离得到的四种化合物进行体外抗肿瘤活性实验。首先利用MTT法，测定它们对肿瘤细胞（A375-S2，Hela和L929）的细胞毒活性。结果表明，内酯苷和苷元对三种细胞都显示出了一定的增殖抑制活性，其中内酯苷元诱导上述细胞死亡呈剂量依赖关系且活性明显高于内酯苷。形态学方法表明内酯苷元组合物诱导A375-S2细胞，HeLa细胞和L929细胞的死亡机制为诱导细胞凋亡。 为研究苷元所诱导的细胞毒活性的机制，本文利用猿猴病毒（SV40）体外DNA复制系统检测了苷元对DNA复制过程的抑制作用，发现苷元1和2均能剂量依赖性地抑制SV40体外DNA复制。为探讨苷元是否通过抑制复制反应所需要的重要的复制蛋白来抑制DNA复制，本文检查了苷元对复制蛋白A（RPA）的单链DNA结合活性的影响。结果表明，苷元1能够剂量依赖性地抑制RPA与单链DNA的结合能力。在浓度达到250μmol/L的时候，超过70％的RPA的单链DNA结合能力被抑制。 为了检测苷元抑制细胞增殖是否通过调节细胞周期的作用，我们利用流式细胞术检测了苷元对A549细胞的细胞周期的影响。结果表明，苷元能够诱导细胞周期阻滞在G2/M期。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语说明
• 第一章 绪论
• 1.1 细胞凋亡与肿瘤
• 1.1.1 细胞凋亡的特征
• 1.1.2 细胞凋亡异常与肿瘤发生
• 1.2 DNA复制过程和一些复制蛋白的抑制作用
• 1.3 细胞周期调控因子与癌变机制
• 1.4 倍半萜内酯类化合物的研究进展
• 1.4.1 倍半萜内酯类化合物的结构类型
• 1.4.2 倍半萜内酯类化合物的药理活性
• 1.5 倍半萜类化合物生物合成途径与相关的酶
• 1.5.1 植物中倍半萜类化合物的生源途径
• 1.5.2 萜类环化酶基因克隆的进展
• 1.5.3 生物信息学应用：DNA序列分析简介
• 第二章 抱茎苦荬菜中倍半萜内酯苷及其苷元的抗癌活性研究
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 药材
• 2.1.2 细胞
• 2.1.3 药品
• 2.1.4 实验试剂
• 2.1.5 实验仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 倍半萜内酯苷及其苷元的制备
• 2.2.2 倍半萜内酯苷及其苷元的细胞毒作用
• 2.2.3 苷元的细胞毒机制
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 倍半萜内酯及其苷元的制备
• 50值'>2.3.2 内酯苷和苷元对三种肿瘤细胞的细胞毒作用即IC₅₀值
• 2.3.3 内酯苷元诱导多种细胞死亡呈明显剂量依赖关系
• 2.3.4 倒置显微镜观察苷元对细胞的作用
• 2.3.5 SV40 DNA体外复制反应
• 2.3.6 RPA的单链DNA结合活性
• 2.3.7 细胞周期阻滞作用
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 第三章 抱茎苦荬菜中吉玛烷A合成酶的基因克隆与体外表达
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 植物材料
• 3.1.2 菌株和质粒
• 3.1.3 酶与试剂
• 3.1.4 培养基
• 3.1.5 引物
• 3.1.6 实验仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 异硫氰酸胍法提取植物总RNA
• 3.2.2 抱茎苦荬菜中吉玛烷A合成酶的基因克隆
• 3.2.3 抱茎苦荬菜中吉玛烷A合成酶在大肠杆菌中的表达
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 兼并引物的设计
• 3.3.2 从抱茎苦卖菜中提取了总RNA
• 3.3.3 紫外检测RNA的纯度和浓度
• 3.3.4 RT-PCR扩增Cs-GAS-1
• 3.3.5 酶切鉴定重组质粒CsGAS-P-1
• 3.3.6 PCR鉴定重组质粒CsGAS-P-1
• 3.3.7 RT-PCR扩增Cs-GAS-2
• 3.3.8 酶切鉴定重组质粒CsGAS-P-2
• 3.3.9 PCR鉴定重组质粒CsGAS-P-2
• 3.3.10 3’RACE扩增Cs-GAS-3
• 3.3.11 酶切鉴定重组质粒CsGAS-P-3
• 3.3.12 PCR鉴定重组质粒CsGAS-P-3
• 3.3.13 5’RACE扩增Cs-GAS-5
• 3.3.14 酶切鉴定重组质粒CsGAS-P-5
• 3.3.15 PCR鉴定重组质粒CsGAS-P-5
• 3.3.16 吉玛烷A合成酶基因cDNA序列及其开放阅读框架
• 3.3.17 RT-PCR扩增Cs-GAS
• 3.3.18 酶切鉴定重组质粒CsGAS-P
• 3.3.19 PCR鉴定重组质粒CsGAS-P
• 3.3.20 序列分析
• 3.3.21 抱茎苦荬菜中吉玛烷A合成酶基因的提交
• 3.3.22 抱茎苦荬菜中吉玛烷A合成酶在大肠杆菌中的表达
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 结论
• 参考文献
• 附图
• 致谢
• 附录