非洲鸵鸟主要免疫器官β-防御素基因克隆及其蛋白质功能的初步研究

论文摘要

抗菌肽广泛存在于多种生物体内,具有广谱抗菌、调节免疫、抑制肿瘤等多种生物学功能。抗菌肽在禽类体内表达的主要是β-防御素,本试验主要针对非洲鸵鸟主要免疫器官β-防御素基因的克隆、序列分析、抗菌活性进行了研究,并与固始鸡主要免疫器官β-防御素基因进行比较分析。1.参照GenBank已公布的鸡β-防御素基因Gal-2（NM20440992）,根据PCR引物的设计原则并借助分子生物学软件primer5.0设计一对引物,从非洲鸵鸟及固始鸡主要免疫器官——胸腺、脾脏及法氏囊中提取RNA,通过反转录及PCR方法扩增出大小约为195bp的基因片段,并将其克隆到PMD19-T载体上,构建重组质粒PMD19-Gal-2,经PCR鉴定及DNA测序鉴定验证,扩增得到的基因为目的β-防御素基因。比较表明:非洲鸵鸟主要免疫器官β-防御素基因序列均为195bp,编码64个氨基酸,与AF033338（435bp）（THP2）、DQ858339（195bp）、DQ858312（195bp）、DQ858299（195bp）等进行比较分析,同源性均达到90%以上。所得的固始鸡β-防御素基因与Gal-2最为接近,并且与火鸡异嗜性白细胞防御素基因亲缘关系较近;而所得的非洲鸵鸟防御素基因与Gal-2、THP2基因由同一分支分化而来,表明其亲缘关系也比较近。由此可得出非洲鸵鸟、固始鸡及火鸡β-防御素基因可能起源于共同的祖先。2.非洲鸵鸟胸腺、脾脏及法氏囊组织抗菌肽的提取及抗菌活性研究。用乙酸浸提法从非洲鸵鸟胸腺、脾脏及法氏囊中提取抗菌肽蛋白,琼脂平板法测定其抑菌活性,用微量肉汤稀释法测定抗菌肽的最小抑菌浓度（MIC）,并计算抑菌率。鸵鸟主要免疫器官——胸腺、脾脏及法氏囊β-防御素基因的成功克隆,是利用了鸡与非洲鸵鸟亲缘关系,根据已报道的鸡Gal-2β-防御素基因设计引物,克隆非洲鸵鸟β-防御素,获得未知基因,克服了Race方法获得全长的繁杂耗时缺点。同时对抗菌肽蛋白抗菌活性研究以及对其最小抑菌浓度的测定,为今后非洲鸵鸟免疫器官功能的研究提供了较好的理论依据。

论文目录

• 致谢
• 中文摘要
• 1. 文献综述
• 1.1 抗菌肽研究进展
• 1.2 防御素
• 1.3 禽类防御素
• 2. 引言
• 3. 试验一：非洲鸵鸟与固始鸡β-防御素基因的克隆及序列分析
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 RT-PCR 扩增
• 3.2.2 目的基因的克隆与鉴定
• 3.2.3 β-防御素基因序列及其推导的氨基酸序列
• 3.2.4 Haryadi Sugiarto 等
• 3.2.5 测得的β-防御素基因核苷酸及推导的氨基酸序列比较
• 3.3 结论与讨论
• 4. 试验二：非洲鸵鸟胸腺、脾脏及法氏囊组织抗菌肽的提取及抗菌活性研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 方法
• 4.2 结果
• 4.2.1 非洲鸵鸟主要免疫器官抗菌肽的提取
• 4.2.2 抗菌活性的测定
• 4.3 结论与讨论
• 小结
• 参考文献
• 英文摘要