论文摘要
背景细胞凋亡即程序性细胞死亡,是由体内外因素触发细胞内预存的死亡程序而导致的细胞死亡过程。研究证实,心肌细胞凋亡在心肌缺血/再灌注损伤、心力衰竭、心肌梗死以及梗死后的心室重构等心血管疾病中起重要作用。因此,有效的抑制心肌细胞凋亡对于改善心血管疾病的预后具有重要作用。阿霉素（Doxorubicin, DOX）是一种蒽环类抗生素,是临床上常用的高效广谱抗肿瘤药物之一。蒽环类抗生素均有心脏毒性,其中以DOX较为严重。研究证实,DOX所致心脏毒性中,心肌细胞凋亡发挥极其重要的作用。近年来,DOX诱导的心肌细胞凋亡模型在对心肌凋亡的研究中广泛应用。补阳还五汤的现代实验研究证明：补阳还五汤对多种心脑血管疾病具有治疗作用。补阳还五汤能抑制脑缺血再灌注损伤；保护动脉粥样硬化模型小鼠的内皮功能,抑制动脉粥样硬化的发展；改善慢性心衰患者的左室收缩及舒张功能；抑制缺氧再给氧所致心肌细胞凋亡。中药血清药理学是指将中药或中药复方经口给动物灌服一定时间后采集动物血液、分离血清,用此含有药物成分的血清进行体外实验的一种实验技术。采用含药血清培养细胞可以直接观察中药的药物学效应,便于应用细胞学和分子生物学手段,从基因、基因产物、药物受体和酶活性等诸方面阐述药理机制,其次,可使现代科学技术与传统医学有了一个切实可行的结合点,推动中医中药的科技进步。目前,中药血清药理学已作为中药药理体外实验研究的常用方法,在中药及其复方研究中得到广泛运用。本研究将探讨补阳还五汤含药血清（Buyanghuanwu Decoction Medicated Serum, BDMS）对DOX诱导的心肌细胞凋亡的影响,为其中医临床治疗心血管疾病进一步提供实验依据。目的本研究采用DOX干预乳鼠原代心肌细胞建立心肌细胞凋亡模型,观察补阳还五汤含药血清对DOX诱导的心肌细胞凋亡的影响。方法1.补阳还五汤含药血清的制备将补阳还五汤水煎剂浓缩至含生药1g/ml,13.6g/kg-d中药水煎液给大鼠灌胃,连续给药7天,于末次给药1h后麻醉条件下腹主动脉采血,将采集的血液于室温下放置3-4h,后以3000rpm离心,分离的血清即为含药血清。2.乳鼠心肌细胞原代培养将出生1-3天的乳鼠心脏于心脏收缩期取出,D-Hanks’液清洗3次后移入无菌青霉素瓶中,用眼科直剪反复剪切为lmmxlmm×lmm大小的组织块,将组织块移入离心管中,在离心管中加入约沉淀量5～8倍的0.1%胰蛋白酶,轻轻吹打混匀,于37℃水浴中静置6min,重复消化5-6次,直到组织块消失,首次遗弃上清（酶）液,后几次收集上清液,即分次收获心肌细胞。将收集的心肌细胞吹打混匀,制成细胞悬液,应用差速贴壁法在培养瓶中培养90min。将细胞悬液种板培养,以去除瓶底贴壁的成纤维细胞,纯化心肌细胞。应用白细胞记数板计数细胞密度,添加培养基调整细胞密度,达4×105/孔（六孔板）或4,000/孔（96孔板）,培养48h～72h,每24h换液一次,后改以含2%FBS的DMEM高糖培养基进行低血清培养24h后,对心肌细胞进行药物处理。3.CCK-8法检测不同浓度DOX对心肌细胞活力的影响将心肌细胞按2×104/ml的密度用含10%FBS的DMEM高糖培养基接种于96孔板,每孔种植200μl。培养48h-72h,每24h换液一次,后改以含2%FBS的DMEM高糖培养基进行低血清培养24h后,对心肌细胞进行药物处理。用含2%胎牛血清DMEM高糖培养基配制药物。将原代心肌细胞随机分成五组：（1）对照组（control）; （2） DOX 0.5uM组；（3）DOX luM组；（4）DOX 2uM组；（5）DOX 4uM组。每组设6个复孔。继续培养24小时,采用CCK-8法检测细胞活力。4.CCK-8法检测2uM DOX在不同时间点时对心肌细胞活力的影响在前述实验结果的基础上,选择2uM作为终浓度,检测不同时间点（6h、12h、24h、48h）对心肌细胞活力的影响。将心肌细胞按2×104/ml的密度用含10%FBS的DMEM高糖培养基接种于96孔板,每孔种植200μl。培养48h-72h,每24h换液一次,后改以含2%FBS的DMEM高糖培养基进行低血清培养24h后,对心肌细胞进行药物处理。用含2%胎牛血清DMEM高糖培养基配制药物。将原代心肌细胞随机分成五组：（1）对照组（control）;（2）DOX 48h组;（3）DOX24h组；（4）DOX 12h组；（5）DOX 6h组。每组设6个复孔。采用CCK-8法检测细胞活力。5. Hoechst 33258核染色检测DOX诱导心肌细胞凋亡将心肌细胞按2×105/ml的密度用含10%FBS的DMEM高糖培养基接种于6孔板,每孔种植2ml。培养48h-72h,每24h换液一次,后改以含2%FBS的DMEM高糖培养基进行低血清培养24h后,对心肌细胞进行药物处理。用含2%胎牛血清DMEM高糖培养基配制药物。将原代心肌细胞随机分成2组：（1）对照组（control）;（2）DOX组。药物作用24h,采用33258核染色检测DOX诱导的心肌细胞凋亡。6.CCK-8法检测补阳还五汤含药血清对心肌细胞活力的影响将心肌细胞按2×104/ml的密度用含10%FBS的DMEM高糖培养基接种于96孔板,每孔种植200μl。培养48h-72h,每24h换液一次,后改以含2%FBS的DMEM高糖培养基进行低血清培养24h后,对心肌细胞进行药物处理。用含2%胎牛血清DMEM高糖培养基配制药物,将细胞随机分为2组：（1）对照组：10%正常血清；（2）10%补阳还五汤含药血清组。每组设6个复孔。继续培养24小时,采用CCK-8法检测细胞活力。7.CCK-8法检测补阳还五汤含药血清对DOX诱导的心肌细胞损伤的影响将心肌细胞按2×104/ml的密度用含10%FBS的DMEM高糖培养基接种于96孔板,每孔种植200μl。培养48h-72h,每24h换液一次,后改以含2%FBS的DMEM高糖培养基进行低血清培养24h后,对心肌细胞进行药物处理。用含2%胎牛血清DMEM高糖培养基配制药物,将细胞随机分为3组：（1）对照组：10%正常血清；（2）10%补阳还五汤含药血清+2uM DOX组；（3）10%正常血清+2uM DOX组。每组设6个复孔。继续培养24小时,采用CCK-8法检测细胞活力。8. Hoechst 33258核染色法检测补阳还五汤含药血清对DOX诱导的心肌细胞凋亡的影响将心肌细胞按2×105/ml的密度用含10%FBS的DMEM高糖培养基接种于6孔板,每孔种植2ml。培养48h-72h,每24h换液一次,后改以含2%FBS的DMEM高糖培养基进行低血清培养24h后,对心肌细胞进行药物处理。用DMEM高糖培养基配置药物。将原代心肌细胞随机分成3组：（1）对照组：10%正常血清；（2）10%补阳还五汤含药血清+2uM DOX组；（3）10%正常血清+2uM DOX组。药物作用24h,采用33258核染色法检测补阳还五汤含药血清对DOX诱导的心肌细胞凋亡的影响。9. Western-Blot法检测心肌细胞中Bax、Bcl-2、p53的蛋白含量NP40裂解液提取心肌细胞中的蛋白,离心。BCA法测定提取上清液中的蛋白质浓度,加入上样缓冲液,10%SDS-PAGE电泳,转膜,脱脂奶粉封闭90min,加入一抗4℃孵育过夜,1×TBS液洗涤3次,加入二抗,37℃孵育,1×TBS液洗涤3次。ECL化学发光试剂盒显色,KODAK Image Station 4000MM图像系统曝光,分析读取条带面积,宽度和灰度值,做统计分析。实验重复3次。10.统计方法数据采用SPSS 13.0统计软件进行分析,结果表示为：均数±标准差（X±SD）。两样本均数结果比较采用Independent-SamplesT Test;多样本均数结果比较采用One-Way ANOVA,方差齐时,组间比较采用Bonferroni,当方差不齐时,采用Welch稳健估计,再采用Dunnett’s T3方法两两比较。以α=0.05为检验标准。结果1.补阳还五汤含药血清制备的结果实验过程无大鼠死亡,含药血清制备顺利。2.心肌细胞原代培养刚分离的心肌细胞呈球形,培养4h后细胞开始贴壁生长,呈现圆形,后变为梭形,细胞在瓶壁不断展开,伸出伪足,变为不规则形；12h细胞基本贴壁,少数贴壁的单个细胞出现自发性搏动,搏动频率及节律不同；第2天可长成单层,第3-4天细胞伸出伪足相互接触交织成网,逐渐形成细胞簇或细胞单层,成放射状排列,搏动呈同步性,收缩显著有力,搏动频率一般在30-120次/mmin。3.不同浓度DOX对心肌细胞活力的影响心肌细胞经不同浓度DOX（0.5uM、luM、2uM、4uM）诱导24h后,与正常对照组相比,各浓度DOX组心肌细胞活力显著下降（P=0.000）。各浓度DOX组间比较,除2uM组与4uM组心肌细胞活力无统计学差异外（P=0.262）,各组随DOX浓度增加心肌细胞活力显著下降（P=0.000）。4.2uM DOX在不同时间点时对心肌细胞活力的影响心肌细胞经2uM DOX分别诱导6h、12h、24h、48h后,与正常对照组相比,发现各时间点DOX组心肌细胞活力均显著下降（P=0.000）。各不同时间点组间比较,除24h与48h组心肌细胞活力无统计学差异外（P=0.491）,各组随时间延长心肌细胞活力下降（P<0.05）。5.DOX诱导心肌细胞凋亡的结果Hoechst荧光染色证实,心肌细胞经2uM DOX、24h诱导后时,细胞呈现凋亡的形态学变化特征：胞体缩小,与周围细胞失去联系,细胞器变致密,核体积缩小,染色体断裂,核膜和细胞膜均内陷,包裹内形成凋亡小体,表明心肌细胞经2uM DOX、24h诱导后,发生了凋亡。6.补阳还五汤含药血清对心肌细胞活力的影响心肌细胞经补阳还五汤含药血清作用24h后,与正常对照组相比,补阳还五汤含药血清有促进心肌细胞活性增加的趋势,且与对照组比较有统计学差异（P=0.008）,提示补阳还五汤含药血清可能对心肌细胞具有保护作用。7.补阳还五汤含药血清对DOX诱导的心肌细胞损伤的影响补阳还五汤含药血清组的细胞活性高于DOX组,且与DOX组比较有统计学意义（P=0.000）,提示补阳还五汤含药血清可抑制DOX诱导的心肌细胞损伤,对心肌细胞具有保护作用。8.补阳还五汤含药血清对DOX诱导的心肌细胞凋亡的影响Hoechst荧光染色证实：对照组细胞核呈弥散均匀的荧光;DOX组细胞呈现凋亡的形态学变化特征：胞体缩小,与周围细胞失去联系,细胞器变致密,核体积缩小,染色体断裂,核膜和细胞膜均内陷,包裹内形成凋亡小体；补阳还五汤含药血清组亦出现凋亡的形态学改变,但其凋亡程度较DOX组明显减轻。9.心肌细胞中Bcl-2、Ba×、p53的蛋白含量Western-blot结果显示：与对照组相比,补阳还五汤含药血清组和DOX组心肌细胞中Bcl-2蛋白含量显著降低（P=0.000）、Bax蛋白含量、p53蛋白含量显著升高（P=0.000）；与DOX组相比,补阳还五汤含药血清组心肌细胞Bcl-2蛋白含量显著升高（P=0.001）、Bax蛋白含量、p53蛋白含量显著降低（P=0.000,P=0.022）。结论1.DOX在一定浓度范围内（≤2uM）呈浓度梯度显著的抑制心肌细胞的细胞活性。2.2uM的DOX在一定时间范围内（<24h）呈时间梯度显著的抑制心肌细胞的细胞活性。3.DOX（2uM 24h）能诱导乳鼠心肌细胞凋亡。4.补阳还五汤含药血清能抑制DOX诱导的心肌细胞损伤以及凋亡。5.补阳还五汤含药血清通过促进心肌细胞Bcl-2蛋白的表达、抑制p53、Bax蛋白的表达,从而抑制心肌细胞凋亡。
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