应用siRNAs抑制乙型脑炎病毒复制及乙型脑炎“自杀性”DNA疫苗研究

论文摘要

乙型脑炎（Japanese encephalitis，JE）（简称乙脑），是由乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus JEV）引起的一种严重危害人畜健康的虫媒病毒性疾病。该病对人类危害巨大，约三分之一的患者会死亡，存活的患者中有40％-70％会留下神经后遗症。乙脑也是危害养猪业的重大疫病之一，该病感染猪造成的主要经济损失是导致严重的繁殖障碍性疾病。目前对于该病还没有有效的治疗方法。RNAi是机体本身存在的天然抗病毒机制，为人们预防和治疗病毒感染开启了希望之门。本实验利用RNAi技术，从抑制病毒复制的角度，为乙脑的免疫预防开辟新途径。同时，本研究还开展了乙脑病毒主要免疫原性基因E和NS1的“自杀性”DNA疫苗研究，并在此基础上探讨了牛疱疹病毒Ⅰ型（BHV-1）的VP22蛋白对乙脑病毒“自杀性”DNA疫苗免疫效果的影响。主要研究内容如下： 1．siRNAs对乙脑病毒NS1基因表达的抑制 以乙脑病毒的NS1基因为靶基因，设计合成了4个siRNA序列，并构建了各自的表达质粒（pS-NS1A，pS-NS1B，pS-NS1C，pS-NS1D）；构建了NS1基因与EGFP融合的真核表达质粒（pCDNS1-EGFP），并实现了二者在Vero细胞和BHK-21细胞中的融合表达；将siRNA表达质粒与pCDNS1-EGFP共转染细胞后，经荧光观察、流式细胞仪检测、Western blot、RT-PCR等方法证实：在4个siRNAs序列中，pS-NS1A的抑制作用不明显，而pS-NS1B、pS-NS1C、pS-NS1D对NS1基因表达有显著的特异性抑制作用，其中pS-NS1C和pS-NS1D抑制效果达到80％—90％。 2．siRNAs对乙脑病毒复制的抑制 将上述构建的4个siRNAs表达质粒分别转染BHK-21细胞，24小时后感染130PFU乙脑病毒，经间接免疫荧光观察、Western blot、空斑形成实验、RT-PCR等方法证实：在4个siRNAs序列中，pS-NS1A的抑制作用不明显，pS-NS1B，pS-NS1C，pS-NS1D对乙脑病毒复制有显著的特异性抑制作用，其中pS-NS1C，pS-NS1D抑制效果达到79％—86％。 3．乙脑病毒E、NS1基因“自杀性”DNA疫苗与常规DNA疫苗的免疫效果比较 将乙脑病毒E和NS1基因分别插入到“自杀性”DNA疫苗载体—PSCAI（pS），分别构建了pSNS1、pSE两种“自杀性”DNA疫苗。在此基础上，将BHV-1的VP22蛋白基因分别插入到NS1、E基因的上游，使VP22与NS1、E基因融合表达，从而构建了另两种“自杀性”DNA疫苗：pSBNS1、pSBE。间接免疫荧光实验证实所构建的质粒均在BHK-21细胞中获得表达。小鼠的动物试验表明：NS1基因的“自杀性”DNA疫苗可以诱导显著高于常规DNA疫苗的ELISA抗体和细胞免疫水平；E基因的“自杀性”DNA疫苗与常规DNA疫苗相比，在诱导体液免疫方面没有优势，

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 英文缩略语表（ABBREVIATION）
• 第1章 前言
• 1.1 乙脑简介和历史背景
• 1.1.1 简介
• 1.1.2.历史背景
• 1.2 乙脑流行病学
• 1.2.1 传染源和传播媒介
• 1.2.2 流行特征
• 1.2.2.1 流行地区
• 1.2.2.2 流行季节
• 1.2.2.3 人群分布
• 1.2.2.4 流行原因
• 1.2.3 致病机制
• 1.3 乙脑的临床症状和病理变化
• 1.3.1 临床症状
• 1.3.2 病理变化
• 1.4 乙脑诊断方法
• 1.4.1 病毒分离
• 1.4.2 病毒抗原检测
• 1.4.3 血清学检测方法
• 1.4.4 其它方法
• 1.5 乙脑的预防和治疗
• 1.5.1 乙脑的预防
• 1.5.2 乙脑的治疗
• 1.6 乙脑病毒的特性
• 1.6.1 乙脑病毒的分类及理化性质
• 1.6.2 乙脑病毒的生物学特性
• 1.6.2.1 血凝特性
• 1.6.2.2 培养特性
• 1.6.2.3 抗原性和基因型
• 1.6.2.4 遗传进化
• 1.6.3 乙脑病毒分子生物学研究进展
• 1.6.3.1 基因组结构和功能
• 1.6.3.2 病毒基因编码的蛋白质
• 1.7 乙脑疫苗研究进展
• 1.7.1 乙脑传统疫苗
• 1.7.1.1 鼠脑灭活疫苗
• 1.7.1.2 地鼠肾细胞灭活疫苗
• 1.7.1.3 减毒活疫苗
• 1.7.2 乙脑新型疫苗
• 1.7.2.1 Vero细胞纯化灭活疫苗
• 1.7.2.2 亚单位疫苗
• 1.7.2.3 核酸疫苗
• 1.7.2.4 活病毒载体疫苗
• 1.8 RNA干扰研究进展
• 1.8.1 RNA干扰的发现
• 1.8.2 RNA干扰的分子生物学机制
• 1.8.3 RNAi的分子生物学特性
• 1.8.4 RNAi抗病毒感染的研究进展
• 1.8.5 RNAi抗病毒作用的问题与展望
• 1.9 新型核酸疫苗——“自杀性”DNA疫苗
• 1.9.1 核酸疫苗研究
• 1.9.1.1 免疫机理
• 1.9.1.2 核酸疫苗的特点
• 1.9.2 RNA复制子研究进展
• 1.9.2.1 甲病毒RNA复制子
• 1.9.2.2 RNA复制子的特点
• 1.9.2.3 甲病毒RNA复制子载体的研究进展
• 1.9.2.4 甲病毒复制子RNA疫苗的应用
• 1.9.3 “自杀性”DNA疫苗
• 1.9.3.1 “自杀性”DNA疫苗的构建
• 1.9.3.2 “自杀性”DNA疫苗的应用
• 1.10 蛋白转导的研究进展
• 1.10.1 几种常见的蛋白质转导域
• 1.10.2 蛋白转导机制
• 1.10.3 BHV-1VP22蛋白转导特性的确定
• 1.10.4 VP22在增强免疫方面的应用
• 第2章 研究目的和意义
• 第3章 材料与方法
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 毒株、细胞与菌种
• 3.1.2 载体与质粒
• 3.1.3 主要药品与试剂盒
• 3.1.4 本研究中所用的寡核苷酸引物
• 3.1.5 主要培养基及其配制
• 3.1.6 缓冲液
• 3.1.6.1 质粒提取用缓冲液
• 3.1.6.2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）缓冲液
• 3.1.6.3 Western blot缓冲液
• 3.1.6.4 ELISA缓冲液
• 3.1.6.5 其它缓冲液
• 3.1.7 实验动物
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 siRNA的设计与合成
• 3.2.2 PCR或酶切产物的回收与纯化
• 3.2.3 大肠杆菌感受态细胞的制备（氯化钙法）
• 3.2.4 连接产物的转化
• 3.2.5 质粒的小量制备（改良的碱裂解法）
• 3.2.6 质粒的大量制备（碱裂解法）
• 3.2.7 脂质体介导转化法（Lipfectin2000,Invitrogen Corp.）
• 3.2.8 RT-PCR方法
• 3.2.8.1 细胞中JEV RNA的提取
• 3.2.8.2 RT-PCR扩增
• 3.2.8.3 RT-PCR反应条件
• 3.2.9 Western blot
• 3.2.10 间接免疫荧光染色法检测外源蛋白在动物细胞中的表达
• 3.2.11 空斑形成实验
• 3.2.12 诱导表达
• 3.2.13 包涵体提取、纯化与复性
• 3.2.13.1 用于SDS-PAGE电泳的包涵体提取
• 3.2.13.2 用于ELISA抗原的包涵体的提取、纯化与复性
• 3.2.14 NS1-ELISA和E-ELISA方法的建立
• 3.2.14.1 最佳包被浓度及血清最佳稀释倍数的确定（方阵滴定）
• 3.2.14.2 ELISA的操作步骤
• 3.2.15 微量中和试验（殷震和刘景华,1997）。
• 3.2.15.1 中和抗体滴度测定
• 3.2.16 小鼠脾淋巴细胞的分离
• 3.2.17 淋巴细胞增殖试验（Lymphocytes Proliferation）
• 3.2.18 统计学分析
• 第4章 结果与分析
• 4.1 SIRNA对JEVNS1基因表达的抑制
• 4.1.1 siRNA表达载体的构建
• 4.1.2 NS1基因与报告基因（EGFP）融合表达载体的构建
• 4.1.3 NS1基因与EGFP融合表达的荧光检测
• 4.1.4 siRNA表达质粒与质粒pCDNS1-EGFP共转染细胞后的荧光检测
• 4.1.5 流式细胞检测EGFP的表达情况
• 4.1.6 Western blot检测情况
• 4.1.7 RT-PCR检测情况
• 4.2 SIRNA对JEV复制的抑制
• 4.2.1 间接免疫荧光检测siRNA对JEV复制的抑制效果
• 4.2.2 Western blot检测siRNA对病毒复制的抑制效果
• 4.2.3 RT-PCR检测siRNA对病毒复制的抑制效果
• 4.2.4 病毒空斑形成实验检测siRNA对病毒复制的抑制效果
• 4.3 乙型脑炎“自杀性”DNA疫苗研究
• 4.3.1 JEV NS1／E“自杀性”DNA疫苗表达质粒的构建
• 4.3.2 “自杀性”DNA疫苗表达质粒的酶切鉴定
• 4.3.3 间接免疫荧光检测“自杀性”DNA疫苗中NS1和E基因在真核细胞中的表达
• 4.3.3 “自杀性”DNA疫苗pSNS1／pSBNS1和pSE／pSBE及常规DNA疫苗pCD NS1／E的体液免疫反应
• 4.3.3.1 免疫小鼠特异性针对JEV NS1／E ELISA抗体检测
• 4.3.3.2 免疫小鼠特异性针对JEV E中和抗体水平检测
• 4.3.4 “自杀性”DNA疫苗pSNS1／pSBNS1和pSE／pSBE及常规DNA疫苗pCD NS1／E的细胞免疫反应
• 第5章 讨论与结论
• 5.1 讨论
• 5.1.1 RNAi-抗乙脑病毒感染的新途径
• 5.1.2 siRNA的靶基因选择
• 5.1.3 siRNA的设计原则
• 5.1.4 NS1在细胞中的定位
• 5.1.5 siRNA对JEV复制的抑制作用
• 5.1.6 乙型脑炎“自杀性”DNA疫苗与常规DNA疫苗的免疫效果比较
• 5.1.7 VP22的免疫增强作用
• 5.2 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢