蚓激酶重组逆转录病毒载体的构建

论文摘要

蚓激酶（lumbrokinase,LK）作为一种新型的溶栓药物,正在广泛应用于心脑血管疾病的预防和治疗。目前临床应用的LK均是从蚯蚓体内直接提取,其制备工艺繁杂,产量较低,因而通过基因工程手段生产大量高纯度的LK已成为一种极有前景的途径。本试验在之前工作基础上构建了含有蚓激酶基因的重组逆转录病毒载体,然后以牛体做为生物反应器,在牛奶中瞬时表达蚓激酶,以期验证载体构建的合理性,为最终获得转基因奶牛等乳腺生物反应器提供一定的理论和实验依据。首先将含有山羊β-酪蛋白基因（β-casein）5’区调控序列（BCP）、蚓激酶基因（lumbrokinase）以及牛生长激素基因polyA（BGHpolyA）序列的表达盒克隆到骨架为Moloney小鼠白血病病毒（缺失基因组）、含有标记基因NeoR的逆转录病毒载体pLNCL中,构建了蚓激酶重组逆转录病毒载体pLN-BCP-LKR。以生理盐水为溶剂,将质粒转染泌乳期奶牛乳腺小叶,收集不同时段奶样,采用纤维蛋白平板溶圈法（Fibrin Agarose Plate Assay,FAPA）检测其纤溶活性,结果显示,BCP作为乳腺特异性启动子能指导目的基因即蚓激酶基因在奶牛乳腺组织实现有效瞬时表达,并且根据FAPA法检测结果表明奶牛乳腺组织在注射重组质粒转染3h后,奶样即出现明显纤溶,6～16h纤溶活性达到最高,持续时间40～60h,有的甚至可达78h,以尿激酶标准品制作标准曲线计算出最高表达量约为40000UK/L牛奶。将表达目的蛋白的奶样经SDS-PAGE凝胶电泳检测,结果显示:表达的蚓激酶分子量约为40kDa。表明牛奶中有蚓激酶的瞬时表达,分子量比理论计算值稍大,可能是其经糖基化等修饰的结果。由于现在没有获得针对蚓激酶的特异性抗体,所以未能进行Western blot检测。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 综述一 蚓激酶的研究概况与进展
• 综述二 动物乳腺生物反应器的研究概况与进展
• 综述三 逆转录病毒载体在转基因中的应用
• 第二章 研究内容
• R的构建及其在奶牛乳腺组织中瞬时表达'>实验一 蚓激酶重组逆转录病毒载体pLN-BCP-LK^R的构建及其在奶牛乳腺组织中瞬时表达
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果与分析
• 4 讨论
• 实验二 蚓激酶重组逆转录病毒载体的包装及其在奶牛乳腺组织中稳定表达
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 第三章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介
• 石河子大学硕士研究生学位论文导师评阅表