AQP4在慢性高眼压大鼠视网膜中的表达

论文摘要

前言水通道蛋白（AQP）的概念源于Koefoed和Johnsen（1953）的研究，之后许多生理学家的实验支持水孔通道的概念。目前已在哺乳动物的体内发现了13种水通道蛋白。就目前的研究而言水通道蛋白主要有三种功能，1易化水的转运；2参与应激后组织水肿的形成；3参与神经信号的传导。在对脑的缺血再灌注模型的研究中发现，AQP4表达在缺血及缺血再灌注过程中发生了上调，抑制其表达可减轻脑水肿和损伤，这说明AQP4参与了脑损伤。AQP4在视网膜存在的细胞与脑组织相似，在对眼球的缺血再灌注模型即急性高眼压模型的研究中发现，抑制AQP4表达同样可以减轻视网膜的损伤。为了进一步探寻AQP4与高眼压视网膜损伤的关系，我们检测了AQP4在慢性高眼压模型大鼠视网膜的表达，并探讨其表达的变化可能与慢性高眼压视网膜损伤的关系。实验材料一、实验动物健康无眼疾、成年、雄性Wistar大鼠75只二、实验试剂10％水合氯醛RNAout分析纯试剂：氯仿、异丙醇、乙醇无RNase水M-MLV逆转录酶[Oligo（dT）15] dNTPs Mix耐热性Taq DNA聚合酶（5u／μl）琼脂糖DEPC TaKaRa RNA PCR kitPCR引物：依照GeneBank为标准primer Express 3.0软件设计APES多聚赖氨酸H2O2苏木素SABC试剂盒Rabbit-anti—AQP4三、实验器材Tonopen眼压计水下电凝器组织显微镜MVE XC47／11-6型液氮罐深冻低温冰箱DIAX900型组织匀浆机FA1604S电子天平4℃冰箱XW-80A漩涡混合器MultiphorⅡ多功能微型电泳仪UVIpro凝胶图像分析系统GeneQuant RNA／DNA分析仪DUPONT SUPER T-21型高速低温离心机Biometra梯度PCR仪2035 Jung Brocut切片机烘箱恒温培养箱OLYMPUS B201显微镜及成像系统实验方法一、慢性高眼压模型的制备电凝大鼠巩膜表面静脉阻断房水外引流途径制成模型二、RT-PCR（一）总RNA的提取（二）逆转录（RT）反应：以RNA为模板合成cDNA的过程反应条件：42℃30分钟，99℃5分钟，5℃5分钟（三） PCR扩增：以RT反应合成的cDNA第一链为模板进行PCR（四） PCR产物的电泳三、免疫组化及HE染色取材固定组织块的脱水透明及石蜡包埋切片染色封片实验结果一、RT-PCR结果AQP4在正常大鼠视网膜有表达，在高眼压大鼠视网膜随着时间的延长，表达逐渐增多，7天时出现表达的高峰，以后虽逐渐降低仍维持在较高水平，7天后各时点视网膜AQP4的表达与对照组差别有显著的统计学意义。二、免疫组化结果AQP4在正常和高眼压大鼠的视网膜都有表达，其表达的部位为：节细胞层，内丛状层，内核层，外丛状层和少量于外核层。慢性高眼压后其表达的变化以内层视网膜较为明显。高眼压后7天达高峰，以后虽有降低但仍维持在较高水平，与对照组相比表达的差异有统计学意义。三、HE结果从HE切片上可以看到，慢性高眼压大鼠视网膜在整个观察时间段内经历了先增厚后变薄的过程，节细胞在此过程中发生了水肿，最后细胞数目明显减少，高眼压过程中视网膜厚度的变化与对照组相比有统计学意义。AQP4表达的变化（IOD）与视网膜厚度的变化密切相关，统计学分析有直线相关关系。讨论AQP4是1994年被克隆确认的水通道蛋白家族中的一员。AQP4广泛存在于哺乳动物体内，主要分布于肺、脑、眼等组织内，在眼部主要分布于睫状体无色素上皮和视网膜。AQP4的功能主要为易化水的转运，新的研究表明，AQP4还与应激状态下的组织水肿有关，另外，一些间接的证据还提示，AQP4还可能和信号转导，细胞容积的调节和细胞器的生理有关。已知在胶质细胞AQP4和kir4.1钾通道在质膜的同一部位共同存在，因此，推测AQP4可能通过虹吸机制加速快速钾转运从而改变细胞外钾的浓度而影响神经信号转导。青光眼的发病机制主要有机械学说和缺血学说，目前更倾向于认为是两种机制共同作用，在对大脑中动脉阻塞引起缺血的研究中发现，脑组织中AQP4的缺乏能对缺血的脑组织起到保护作用，脑组织中表达AQP4的胶质细胞对神经元所起的支持作用和表达AQP4的胶质细胞对苗勒细胞、双极细胞、节细胞的作用相似。包含有离子、神经递质和各种大分子物质的视网膜细胞外间隙形成了苗勒细胞、双极细胞、节细胞生存的微环境，使通过溶质扩散的细胞-细胞间交流更易进行。理论上，苗勒细胞上AQP4的缺乏，和苗勒细胞水通透性的降低能改变细胞和细胞外间隙的体积和成分。和其他电兴奋组织一样，细胞肿胀和细胞外间隙稳态的变化可能会导致神经元损伤和细胞凋亡。通过对AQP4表达和视网膜厚度的相关性分析我们发现，二者的变化有一定的联系，AQP4的功能提示它可能和慢性高眼压过程中视网膜组织的水肿及凋亡信号的转导有关，因此，AQP4表达的变化可能参与了慢性高眼压过程中视网膜的损伤。结论1、AQP4在视网膜表达的部位，表达于节细胞层、内丛状层、内核层，外丛状层，并少量表达于外核层。2、AQP4的表达在慢性高眼压的过程中出现上调，且和视网膜厚度的变化密切相关，提示，AQP4可能通过多种机制参与了慢性高眼压过程中视网膜的损伤。

论文目录

• 一、摘要
• 中文论著摘要
• 英文论著摘要
• 二、英文缩略语
• 三、论文
• 前言
• 实验材料与方法
• 实验结果
• 讨论
• 结论
• 四、本研究创新性的自我评价
• 五、参考文献
• 六、附录
• 综述
• 在学期间科研成绩
• 致谢
• 个人简介