青霉素G酰化酶的克隆表达及在手性邻氯苯甘氨酸合成中的应用

论文摘要

光学纯邻氯苯甘氨酸是一种具有广泛用途的药物中间体,其中（S）-邻氯苯甘氨酸在全球热销的“重磅炸弹”药物氯吡格雷合成中扮演着不可或缺的重要手性中间体角色。青霉素G酰化酶（PGA）对含苯环的酰基侧链有高度立体选择性,能够选择性的将苯乙酰化的外消旋邻氯苯甘氨酸水解,生成（S）-邻氯苯甘氨酸,而R-型的酰化衍生物保持构型不变,未水解的R-型底物进行消旋化反应继续循环拆分,以此来建立立体选择性青霉素G酰化酶催化生产（S）-邻氯苯甘氨酸的生产工艺。本论文首先构建了青霉素G酰化酶基因工程菌,研究了青霉素G酰化酶在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中的表达情况。以大肠杆菌为宿主菌时,选择pCDFDute-1作为表达载体,构建重组菌Escherichia coli BL21（DE3）/pCDFDute-PGA,通过菌落 PCR 和 SDS-PAGE 分析,证明重组菌已构建成功,但酶活较低。以枯草芽孢杆菌为宿主时,选择pPZW103作为表达载体,构建重组菌Bacillus subtilis WB800/pPZW103-PGA,SDS-PAGE分析证明重组菌构建成功,重组枯草芽孢杆菌B.subtilis WB800/pPZW103-PGA可以胞外表达青霉素G酰化酶。以重组菌B.subtilis WB800/pPZW103-PGA为出发菌株,通过单因素法得出了菌株最佳的青霉素G酰化酶产酶条件:可溶性淀粉10 g/L、蛋白胨 12g/L、酵母粉 3g/L、NaCl10g/L;pH7.5、培养温度37℃、装液量80mL/500mL,培养28h,青霉素G酰化酶的表达水平由最初的7.34 U/mL提高至18.23 U/mL,相比于优化前酶活提高了 2.48倍。在S L发酵罐中对重组菌B.subtilis WB800/pPZW103-PGA进行了放大培养。对重组菌B.subtilis WB800/pPZW103-PGA产青霉素G酰化酶进行了分离纯化和部分酶学特性的研究。通过硫酸铵盐析、离子交换层析、疏水作用层析等蛋白质纯化技术,得到了电泳纯的青霉素G酰化酶。青霉素G酰化酶的纯化倍数为4.6倍,酶活回收率为55.5%,含有大小约为24.2 kDa和61.4 kDa的α和β两个亚基。纯化的PGA在偏碱性的条件下酶活最高,最适宜的转化pH值范围为9.0-10.0。该酶最适反应温度为50 ℃,在40 ℃和50 ℃半衰期分别为75.4 h和24.8h。Fe2+、Ag+、Al3+和SDS对PGA有较强的抑制作用,Co2+对酶活有促进作用,表面活性剂吐温-80和山梨醇对酶活影响不明显。对该酶的底物特异性进行研究,重组PGA对各个底物均具有较高的催化活性和立体选择性,反应结束后产物e.e.值均在99.9%以上,对各底物都是S型选择性。测定了重组PGA对五种不同底物的米氏常数Km、最大反应速率Vm、催化常数kcat及表观二级速率常数kcat/Km。通过分子对接阐明了青霉素G酰化酶的催化机理同时也解释了酶对五种底物催化差异的原因。论文最后研究了重组PGA催化拆分苯乙酰化的外消旋邻氯苯甘氨酸制备（S）-邻氯苯甘氨酸的催化条件。以pH 10.0的氨水溶液作为反应体系,反应温度40 ℃,确定酶浓度0.126 mg/mL,当底物浓度为110 mM时,产物浓度达48.11mM,e.e.p>99.9%。通过分批补料,底物消耗180 mM,最终产物浓度达到79.53 mM。经产物的分离和提取,制备（S）-邻氯苯甘氨酸3.5 g,总收率达47.15%。样品经旋光仪和核磁共振、液相色谱表征,表明其化学纯度和光学纯度均达到99%以上。对未反应的R-底物进行了外消旋化研究,用于循环拆分,消旋率100%,消旋收率达94.7%,同时对副产物苯乙酸也进行了分离,收率69.7%。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 青霉素酰化酶
• 1.1.1 青霉素酰化酶的分类与来源
• 1.1.2 青霉素G酰化酶的结构和表达
• 1.1.3 青霉素G酰化酶的催化机理
• 1.1.4 青霉素G酰化酶的克隆研究进展
• 1.1.4.1 Escherichia coli PGA的克隆
• 1.1.4.2 Bacillus megaterium PGA的克隆
• 1.1.4.3 Alcaligenes faecalis PGA的克隆
• 1.1.4.4 Kluyvera citrophila PGA的克隆
• 1.1.4.5 Achromobacter xylosoxidans PGA的克隆
• 1.1.4.6 Provdencia rettgeri PGA的克隆
• 1.1.4.7 PGA克隆表达的宿主菌
• 1.1.4.8 不同来源PGA生产菌的优缺点
• 1.1.5 青霉素G酰化酶的应用
• 1.1.5.1 PGA在半合成抗生素中间体制备中的应用
• 1.1.5.2 在半合成β-内酰胺抗生素合成中的应用
• 1.1.5.3 在外消旋混合物的拆分中的应用
• 1.1.5.4 PGA在肽合成中的应用
• 1.2 邻氯苯甘氨酸
• 1.2.1 外消旋体拆分法
• 1.2.1.1 外消旋体的合成
• 1.2.1.2 外消旋体的拆分
• 1.2.1.2.1 非对映体盐拆分法
• 1.2.1.2.2 诱导结晶法
• 1.2.1.2.3 不对称转化拆分法
• 1.2.1.2.4 生物酶拆分法
• 1.2.2 不对称合成
• 1.2.2.1 不对称相转移催化法
• 1.2.2.2 生物酶转化法
• 1.3 本论文的选题意义及研究内容
• 参考文献
• 第二章 青霉素G酰化酶基因工程菌的构建及表达
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 菌株与质粒
• 2.2.2 培养基
• 2.2.3 主要工具酶和试剂
• 2.2.4 主要实验仪器
• 2.2.5 PGA在大肠杆菌中的表达
• 2.2.5.1 PGA基因组的提取及PCR扩增
• 2.2.5.2 电泳检测PCR产物
• 2.2.5.3 青霉素G酰化酶基因PGA的克隆
• 2.2.5.4 双酶切体系的建立
• 2.2.5.5 胶回收酶切片段
• 2.2.5.6 胶回收产物与pCDFDuet-1的连接
• 2.2.5.7 大肠杆菌感受态的制备
• 2.2.5.8 连接产物的转化
• 2.2.5.9 菌落PCR
• 2.2.5.10 PGA基因的诱导表达
• 2.2.5.11 重组PGA的SDS-PAGE分析
• 2.2.5.12 重组菌E. coli BL21（DE3） /pCDFDuet-PGA的酶活检测
• 2.2.6 PGA在枯草芽孢杆菌中的表达
• 2.2.6.1 质粒pBluescript SK（+）-PGA和pPZW103的提取
• 2.2.6.2 酶切
• 2.2.6.3 胶回收酶切片段
• 2.2.6.4 胶回收产物与pPZW103的连接
• 2.2.6.5 枯草芽孢杆菌感受态的制备
• 2.2.6.6 连接产物的电转化
• 2.2.6.7 重组PGA的表达
• 2.2.6.8 重组菌B.subtilis WB800/pPZW103-PGA的酶活检测
• 2.2.7 分析方法
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 PGA在大肠杆菌中的表达
• 2.3.1.1 PGA的α和β亚基克隆
• 2.3.1.2 重组表达载体的构建
• 2.3.1.3 重组质粒的菌落PCR鉴定
• 2.3.1.4 表达产物SDS-PAGE分析
• 2.3.1.5 重组PGA酶活力的测定
• 2.3.2 PGA在枯草芽孢杆菌中的表达
• 2.3.2.1 PGA基因序列的合成
• 2.3.2.2 重组表达载体的构建
• 2.3.2.3 重组PGA的SDS-PAGE分析
• 2.3.2.4 重组PGA酶活力的测定
• 2.3.2.5 pPZW103-PGA质粒稳定性的检测
• 2.3.3 讨论
• 2.4 本章小结
• 参考文献
• 第三章 B.subtilis WB800/pPZW103-PGA培养条件的研究
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 菌种
• 3.2.2 培养基
• 3.2.3 培养方法
• 3.2.4 胞外酶液催化水解N-苯乙酰-邻氯苯甘氨酸
• 3.2.5 生物量测定
• 3.2.6 分析方法
• 3.2.7 发酵优化
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 产物底物的分析
• 3.3.2 重组菌B.subtilis WB800/pPZW103-PGA发酵条件的优化
• 3.3.2.1 碳源的种类及浓度对菌体生长及产酶的影响
• 3.3.2.2 氮源对菌体生长和产酶的影响
• 3.3.2.3 磷酸盐对菌体生长和产酶的影响
• 3.3.2.4 金属离子对菌体生长和产酶的影响
• 3.3.2.5 初始pH对菌体生长和产酶的影响
• 3.3.2.6 培养温度对菌体生长和产酶的影响
• 3.3.2.7 摇瓶装液量对重组菌生长和PGA表达的影响
• 3.3.2.8 接种量对菌体生长和酶活力的影响
• 3.3.2.9 间歇培养过程中菌体生长及产酶曲线
• 3.3.3 5L发酵罐中菌体的生长以及产酶曲线
• 3.4 本章小结
• 参考文献
• 第四章 重组青霉素G酰化酶的分离纯化及酶学特性研究
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 菌株
• 4.2.2 培养基
• 4.2.3 实验试剂
• 4.2.4 主要仪器
• 4.2.5 主要溶液
• 4.2.6 蛋白质浓度测定
• 4.2.7 重组PGA活力的测定
• 4.2.8 重组PGA的分离纯化
• 4.2.8.1 硫酸铵初级盐析
• 4.2.8.2 硫酸铵次级盐析
• 4.2.8.3 弱碱性离子交换层析
• 4.2.8.4 疏水相互作用层析
• 4.2.8.5 SDS-PAGE电泳
• 4.2.8.6 蛋白质分子量的确定
• 4.2.9 重组PGA的酶学性质研究
• 4.2.9.1 重组PGA的最适pH及pH稳定性
• 4.2.9.2 重组PGA的最适温度及温度稳定性
• 4.2.9.3 金属离子和表面活性剂对重组PGA酶活的影响
• 4.2.9.4 重组PGA底物特异性的研究
• 4.2.9.4.1 底物的合成
• 4.2.9.4.2 手性色谱柱上不同底物产物的分离
• 4.2.9.4.3 重组PGA催化水解不同底物能力的比较
• 4.2.9.4.4 重组PGA催化各底物动力学常数的比较
• 4.2.9.4.5 同源建模及五种底物的分子对接
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 重组PGA的分离纯化
• 4.3.1.1 蛋白质标准曲线
• 4.3.1.2 硫酸铵分级盐析
• 4.3.1.2.1 硫酸铵初级盐析
• 4.3.1.2.2 硫酸铵次级盐析
• 4.3.1.3 DEAE弱碱性离子交换层析
• 4.3.1.4 t-Butyl疏水相互作用层析
• 4.3.1.5 各步PGA的比活力、回收率和纯化倍数
• 4.3.1.6 酶纯度的鉴定和分子量测定
• 4.3.2 重组PGA的酶学特性
• 4.3.2.1 重组PGA最适pH的测定
• 4.3.2.2 重组PGA的pH稳定性
• 4.3.2.3 重组PGA最适温度的测定
• 4.3.2.4 重组PGA的热稳定性
• 4.3.2.5 金属离子和表面活性剂对重组PGA酶活的影响
• 4.3.2.6 重组PGA的底物特异性
• 4.3.2.6.1 底物的合成
• 4.3.2.6.2 色谱柱上不同底物产物的分离
• 4.3.2.6.3 重组PGA催化水解不同底物能力的比较
• 4.3.2.6.4 重组PGA催化各底物动力学参数的比较
• 4.3.2.6.5 同源建模及五种底物的分子对接
• 4.4 本章小结
• 参考文献
• 第五章 重组青霉素G酰化酶催化拆分制备（S）-邻氯苯甘氨的研究
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 菌株
• 5.2.2 化学试剂及树脂
• 5.2.3 主要仪器
• 5.2.4 酶液的制备
• 5.2.5 酶法拆分N-苯乙酰-（R,S）-邻氯苯甘氨酸
• 5.2.6 底物分批补料
• 5.2.7 产物的制备及表征
• 5.2.8 （R）-底物的外消旋化
• 5.2.9 分析方法
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 反应体系pH对PGA催化拆分的影响
• 5.3.2 不同酶量对PGA催化拆分的影响
• 5.3.3 底物浓度对PGA催化拆分的影响
• 5.3.4 产物浓度对PGA催化拆分的影响
• 5.3.5 分批补料
• 5.3.6 （S）-邻氯苯甘氨酸的制备及表征
• 5.3.7 （R）-2的消旋
• 5.4 本章小结
• 参考文献
• 第六章 结论与展望
• 6.1 结论
• 6.2 展望
• 附录
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢